蜂蜜中氯霉素分析方法的研究概況及展望

余志清

摘 要：氯霉素作為違禁藥品，其殘留物在蜂蜜中的檢出顯示出不良商家在養(yǎng)殖過程中存在不同程度的濫用。為了能對(duì)其殘留量準(zhǔn)確分析，從而將此類情況嚴(yán)格控制在源頭，國(guó)內(nèi)外都有不同的分析方法。本文主要對(duì)目前運(yùn)用較多的酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜法、分子印跡法、膠體金免疫層析法、電化學(xué)法進(jìn)行概述，并分析不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)，從而對(duì)蜂蜜中氯霉素殘留量的檢測(cè)方法進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：氯霉素；蜂蜜；分析方法

中圖分類號(hào)：S896.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2018）13-0224-02

中國(guó)是蜂蜜生產(chǎn)及出口大國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)蜂蜜2017年11月份出口量約為1100萬(wàn)千克，出口金額約為2300萬(wàn)美元。歐盟是世界上重要的蜂蜜進(jìn)口地區(qū)，而我國(guó)是蜂蜜出口的主要市場(chǎng)之一，自2006年來(lái)歐盟食品和飼料預(yù)警系統(tǒng)RAAFF中有關(guān)從中國(guó)進(jìn)口蜂蜜的通報(bào)有31例，其中90%以上是由抗生素殘留超標(biāo)引起的[1]。我國(guó)目前已出臺(tái)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蜂蜜中氯霉素的殘留進(jìn)行限定，其中農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告明確規(guī)定氯霉素為禁用藥物。氯霉素（Chloramphenicol，CAP）又稱氯胺苯醇或做霉素。主要成分是由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌產(chǎn)生的代謝物，商業(yè)制劑為白色針狀或微帶黃綠色的針狀、長(zhǎng)片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，味苦。長(zhǎng)期使用可引起視神經(jīng)炎、共濟(jì)失調(diào)以及由于菌群失調(diào)而致的微生物素缺乏等不良反應(yīng)。兒童應(yīng)用本品，可引起循環(huán)衰竭、貧血、出血傾向和反復(fù)感染，甚至誘發(fā)再生障礙性貧血[2]。而養(yǎng)蜂過程中濫用氯霉素預(yù)防或治療蜂蜜疾病是我國(guó)蜂蜜氯霉素含量超標(biāo)的主要原因，且其殘留對(duì)蜂蜜品質(zhì)的影響是長(zhǎng)期的。因此，通過進(jìn)一步加強(qiáng)“從養(yǎng)蜂到餐桌”全程的獸藥殘留監(jiān)控，才能保證我國(guó)蜂蜜的品質(zhì)，從而減少對(duì)我國(guó)蜂蜜出口的影響。

從目前我國(guó)蜂蜜中氯霉素殘留量檢測(cè)方法的現(xiàn)狀來(lái)看，主要分為酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，同時(shí)包括中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜法、分子印跡法、膠體金免疫層析法、電化學(xué)法。

1 酶聯(lián)免疫法

目前，現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中有2個(gè)酶聯(lián)免疫法針對(duì)蜂蜜中氯霉素的檢測(cè)，均基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定，且在450nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度值得出樣品中氯霉素的殘留量。

同時(shí)，劉姚等[3]以抗氯霉素單克隆抗體為包被原，氯霉素-辣根過氧化物偶聯(lián)物為標(biāo)記物，TMB作顯色底物，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、包被溫度、包被抗體稀釋倍數(shù)等六個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了曲線方程式為y=-17.425x+97.509的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9913，且蜂蜜樣品的檢測(cè)限和定量限分別為0.15ng/g和0.33ng/g，添加回收率在97.58%～100.94%之間，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于11%；另外整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)過程耗時(shí)約為40min。表明該方法具有高精確度高穩(wěn)定性。

2 氣相氣質(zhì)法

由于氯霉素均含有電子親和性強(qiáng)的化學(xué)基團(tuán)，這使得利用氣相色譜-電子俘獲檢測(cè)法對(duì)蜂蜜中的氯霉素進(jìn)行檢測(cè)成為可能。目前常用的氣質(zhì)檢測(cè)方法通常采用GB/T 18932.20 -2003和農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-10-2006，均采用水溶解蜂蜜試樣，并用乙酸乙酯提取，將提取液濃縮后再用水溶解，經(jīng)固相萃取柱凈化、洗脫、氮吹后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法進(jìn)行定量。

3 液相液質(zhì)法

液相色譜及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀是目前檢測(cè)蜂蜜中氯霉素較為成熟且回收率基質(zhì)干擾較少的一種快速檢測(cè)方法。吳華等[4]建立了高效液相色譜檢測(cè)蜂蜜中氯霉素殘留的方法。樣品先用NaOH進(jìn)行堿化，經(jīng)高速離心沉淀大部份有機(jī)酸、極性雜質(zhì)，再用乙酸乙酯提取氯霉素。提取物在流動(dòng)相甲醇∶0.2%磷酸氫二銨緩沖液=40∶60的條件下，在波長(zhǎng)278nm處測(cè)定氯霉素。該方法最低檢出濃度為0.01μg/g，在0.1～10μg/mL范圍內(nèi)，線性方程為y=60.404x+2.5945，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。加樣回收率為82.9%～86.7%，RSD為5.1%～6.0%。

馮雷等[5]則研究一種針對(duì)蜂蜜中氯霉素殘留量的液質(zhì)聯(lián)用分析方法。采用水溶解蜂蜜，用乙酸乙酯萃取蜂蜜水溶液中的氯霉素，氮吹至干后用水溶解樣品殘?jiān)?，然后用HLB小柱進(jìn)行固相萃取，對(duì)樣品中的氯霉素進(jìn)行凈化前處理。以乙腈-水作為流動(dòng)相，C18色譜柱對(duì)蜂蜜的氯霉素進(jìn)行分離，然后用電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)氯霉素進(jìn)行檢測(cè)，縮短了色譜分離時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度和分析結(jié)果可靠性，具有準(zhǔn)確、快速以及高靈敏度和高選擇性的特點(diǎn)，能夠適應(yīng)大規(guī)模樣品的快速分析要求。

胡曉慧等[6]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立快速痕量檢測(cè)蜂蜜中氯霉素的方法。該方法以氘代氯霉素（D5-氯霉素）為內(nèi)標(biāo)，在超聲波輔助下，樣品用乙酸乙酯進(jìn)行堿性提取、凈化后，以乙腈-水為流動(dòng)相，并在電噴霧離子源負(fù)離子模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)氯霉素的定性、定量分析，分析時(shí)間為8min。在檢測(cè)范圍為0.1～20μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.9990。當(dāng)添加水平分別為0.20、0.50、5.0μg時(shí)，氯霉素的加標(biāo)回收率為84.0%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.95%～5.04%。方法檢出限為0.013μg/kg，定量限為0.025μg/kg。從而建立的方法快速高效，樣品前處理簡(jiǎn)單，選擇性好，靈敏度高，適用于蜂蜜中氯霉素殘留的痕量檢測(cè)。

4 中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜法

中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜技術(shù)是利用斜對(duì)放置的進(jìn)氣管和樣品管提取和凈化待測(cè)樣品，再將樣品流引入電噴霧萃取電離源，帶電液與樣品液滴進(jìn)行碰撞融合，發(fā)生液液萃取和電荷轉(zhuǎn)移進(jìn)而達(dá)到去溶劑的效果，最終對(duì)待測(cè)物進(jìn)行質(zhì)譜分析[7]。

劉星星等[8]利用自行研制的中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜技術(shù)建立了在無(wú)需樣品預(yù)處理的條件下，對(duì)蜂蜜中氯霉素快速直接檢測(cè)的方法。通過張茜等[9]對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，采用了用硝酸銀溶液（10mg/mL）為萃取劑，甲醇為中性解吸噴霧試劑，電噴霧萃取劑的流速為5μg/min，電噴霧電壓為4.5kV，離子源霧化氣的壓力為1MPa，離子源離子傳輸管的溫度為250℃，解吸氣所帶甲醇噴霧的流速為14μg/min的條件下，得到檢測(cè)蜂蜜中氯霉素的更佳方法。

5 分子印跡法

分子印跡技術(shù)是指當(dāng)模板分子（印跡分子或待測(cè)物）與聚合物單體接觸時(shí)會(huì)形成多重作用點(diǎn)，通過聚合過程這種作用就會(huì)被記憶，當(dāng)模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子空間構(gòu)型相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，這樣的空穴將對(duì)模板分子及其類似物具有選擇識(shí)別特型[7]?；诜肿佑≯E技術(shù)，陳海燕等[10]采用微波輔助法快速制備以氯霉素為模板分子的分子印跡聚合物。將合成的聚合物作為吸附劑，選擇性分離和富集蜂蜜樣品中的氯霉素，并結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)萃取物進(jìn)行分析。對(duì)合成的分子印跡聚合物進(jìn)行了表征，考察了聚合物的吸附性能及其選擇性，并進(jìn)行了Scatchard分析。結(jié)果表明，合成的聚合物為球形，對(duì)氯霉素具有良好的識(shí)別能力，最大表觀結(jié)合量可達(dá)0.428mmol/g。該方法的線性范圍為0.5～100ng/g，相關(guān)系數(shù)>0.999，蜂蜜中氯霉素的檢出限為0.13ng/g，6種蜂蜜樣品中氯霉素的加標(biāo)回收率范圍為88%～93%。得到了一種低檢出限、高回收率的快速分析方法。

6 膠體金免疫層析法

王元鳳等[11]通過肉眼觀測(cè)試紙條顯色情況、金標(biāo)圖像分析和ELISA試劑盒檢測(cè)回收率，并結(jié)合試劑條自身特性采用了回收率最高的處理方法對(duì)蜂蜜中氯霉素殘留檢測(cè)，即稱取4g試樣于15ml離心管中，加入2ml蒸餾水振蕩充分溶解。加入8ml乙酸乙酯，上下翻轉(zhuǎn)振蕩8min，靜置至上層有機(jī)相澄清，轉(zhuǎn)移5ml上層有機(jī)溶劑于5ml刻度冷凍管中，電吹風(fēng)吹干。加入160μlPBST緩沖液，溶解試管壁殘留，再加入1ml正己烷充分振蕩后靜置分層，吸取下層水相進(jìn)行待檢。結(jié)果表明，該分析方法具有選擇性好、靈敏度高的特點(diǎn)。

7 電化學(xué)法

張其美等[12]針對(duì)氯霉素建立了2種電化學(xué)檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)中，主要內(nèi)容如下：（1）通過多巴胺的自聚在玻碳電極表面修飾一層聚多巴胺膜，進(jìn)一步通過過氧化處理制得過氧化聚多巴胺膜修飾電極，并采用方波伏安法對(duì)蜂蜜中的氯霉素殘留進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，玻碳電極在2mg/mL多巴胺溶液中自聚2.5h，并在0.5mol/L的NaOH溶液中過氧化處理后得到聚多巴胺膜修飾電極，在氯霉素溶液中采用SWV陰極掃描時(shí)具有最佳的出峰效果。峰電流與氯霉素的濃度3.0×10-6～1.1×10-3mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為7.8×10-7mol/L。該修飾電極制備方法簡(jiǎn)便易行、成本低、便于批量制備，用于檢測(cè)氯霉素操作簡(jiǎn)單、選擇性好，適用于蜂蜜等食品樣品中氯霉素殘留的測(cè)定。（2）以氯霉素為模板分子，鄰苯二胺為功能單體，采用電化學(xué)聚合法在鉑微電極表面形成聚鄰苯二胺膜，經(jīng)洗脫液將模板分子洗脫，制得氯霉素分子印跡傳感器，并用于快速和選擇性檢測(cè)蜂蜜樣品中的氯霉素。該傳感器的響應(yīng)值與氯霉素的濃度在9.0×10-10～1.0×10-8mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為3.9×10-10mol/L。運(yùn)用建立的方法對(duì)市售蜂蜜中的氯霉素進(jìn)行測(cè)定，并用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行了方法驗(yàn)證。結(jié)果表明，該傳感器具有良好的選擇性和較高的靈敏度，便于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和分析，具有很好的應(yīng)用前景。

8 綜述與展望

以上所述的氯霉素殘留物檢測(cè)方法中，酶聯(lián)免疫法具有方便、快速、易攜帶的優(yōu)點(diǎn)，適合氯霉素殘留物的初步篩選，較易出現(xiàn)假陽(yáng)性的特點(diǎn)。近年來(lái)，液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀越來(lái)越多應(yīng)用于蜂蜜中氯霉素的檢測(cè)，具有高效、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但由于其儀器價(jià)格不菲，一直未大范圍使用。而分子印跡、電化學(xué)方法的興起，必將有力推進(jìn)現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法的快速檢測(cè)，對(duì)政府部門的監(jiān)督起到一定的推動(dòng)作用，從而從源頭上控制住氯霉素的使用情況。

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