心肌原位緩釋胎盤生長因子納米粒注射用于大鼠心肌梗死的效果評(píng)價(jià)

包華健，何 靜

0 引言

心肌梗死(Myocardial infarction，MI)使疤痕形成，影響心臟的收縮功能，最終導(dǎo)致心力衰竭[1]，其治療方式包括藥物治療、心臟移植和植入式左心室輔助裝置(LVADs)。然而器官供體供應(yīng)有限，LVAD并發(fā)癥發(fā)病率高[2]。理想的治療方法是能夠通過血管再生來促進(jìn)新的心肌細(xì)胞生成并刺激缺血區(qū)的血管生成來保持心臟功能[1,3]。

胎盤生長因子(PLGF)可刺激新生血管形成，改善心臟功能。PLGF屬于血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)家族成員，與VEGF比較，PLGF不僅具有更強(qiáng)的促進(jìn)血管新生作用，且很少有低血壓、水腫、纖維素沉積以及刺激新生血管瘤等不良作用[4]。

盡管心肌梗死的藥物治療取得了進(jìn)展，但遞送生長因子仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的過程，因?yàn)榇蠖鄶?shù)生物因子不留在指定的部位(即梗死組織)。原因可能包括遞送方式、局部酶退化、動(dòng)物樣本的差異和收縮心肌“洗脫”機(jī)制[5-7]，可通過納米粒子來實(shí)現(xiàn)藥物遞送。以往的PLGF遞藥途徑存在易分解代謝、分布不均等問題。殼聚糖和海藻酸鈉具有較好的生物相容性和極小毒性，可用于制備微膠囊，在臨床胰島細(xì)胞移植研究中可選擇殼聚糖/海藻酸鈉作為胰島細(xì)胞載體[8]。同時(shí)，海藻酸鈉是第一種進(jìn)入臨床試驗(yàn)治療心梗的材料，其缺點(diǎn)是親水性過強(qiáng)，不易與細(xì)胞結(jié)合，殼聚糖結(jié)合可以改善海藻酸鈉與細(xì)胞間的相互作用[9]。我們選擇殼聚糖/海藻酸鈉作為納米遞送材料，其主要優(yōu)勢(shì)在于：納米粒性質(zhì)穩(wěn)定；一次給藥后，藥物可緩慢釋放較長時(shí)間；良好的生物相容性；降解產(chǎn)物無毒性[6]。本研究中，我們首次在心肌內(nèi)注射載PLGF殼聚糖-藻酸鹽納米粒，推測(cè)其可提供持續(xù)緩釋保護(hù)效果，加速缺血性心肌病大鼠模型中的心肌恢復(fù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性Lewis大鼠(體重200～250 g；由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。平衡飼養(yǎng)1周后，將大鼠分組。

1.1.2 主要試劑 來自棕藻的低黏度海藻酸鈉鹽(黏度：250 cP，2%水溶液)，購自Sigma Chemicals(St Louis，MO)。殼聚糖(低黏度，73.5%脫乙酰)，購自Wako BioProducts(Richmond，VA)。重組PLGF購自R&D Systems公司(Minneapolis，MN)。

1.1.3 儀器 微尖探頭超聲波超聲儀(Branson 2510；克利夫蘭，俄亥俄州)；超速離心機(jī)(Optima MAX；美國Beckman公司)；G1316A溫控箱；CM-200 FEG透射電子顯微鏡(Philips，Markham，加拿大)；Zeta電位分析儀電泳激光多普勒測(cè)速儀(Brookhaven Instruments Corp，Holtsville，NY)；ZetaPlus粒度測(cè)定儀(v4.11;BrookhavenInstruments Corporation)；7/0聚丙烯縫合線(Ethicon Inc，Somerville，NJ)；胸超聲心動(dòng)圖(飛利浦IE33，12 MHz探頭)。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖-海藻酸鈉納米粒的制備 參考Rajaonarivony等[10]的方法。將氯化鈣溶液(2 ml，0.67 mg/ml)滴加至濃度為1.0 mg/ml PLGF的10 ml海藻酸鈉溶液(0.6 mg/ml)，同時(shí)用微尖探頭超聲儀處理1 min(50 W)。將所得的藻酸鈣預(yù)凝膠移至燒杯中，攪拌30 min，然后加入3% v/v乙酸的殼聚糖溶液(2 ml，0.3 mg/ml)攪拌30 min。將所得懸浮液放置24 h，4 ℃ 140 000 g超速離心60 min分離納米粒；通過超聲處理將所得沉淀物重新分散于蒸餾水中1 min，通過超速離心將納米粒在水中洗滌2次。空白納米粒采用相同的制備方法，制備過程中不加PLGF。

1.2.2 載PLGF殼聚糖-藻酸鹽納米粒的體外釋放 載PLGF納米粒懸浮于20 ml磷酸鹽緩沖鹽水(pH=7.4)中，置于37 ℃的恒溫環(huán)境中水平搖動(dòng)(100 r/min)。于適當(dāng)時(shí)間間隔，分別取出1 ml培養(yǎng)基，并以等量磷酸鹽緩沖鹽水補(bǔ)充至釋放介質(zhì)。通過PLGF酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定不同時(shí)間釋放的PLGF濃度。

1.2.3 納米粒子的形態(tài)及粒徑 Zeta Plus粒度測(cè)定儀和透射電鏡分別確定納米粒子尺寸分布和形態(tài)，Zeta電位分析儀測(cè)量Zeta電位。測(cè)量3次，取平均值。

1.2.4 動(dòng)物模型建立與分組 大鼠隨機(jī)分為4組，除假手術(shù)組外，每組10只：對(duì)照組Ⅰ(空白殼聚糖-藻酸鹽納米粒)，治療組Ⅱ(1 μg重組PLGF與生理鹽水稀釋成300 μl)，治療組Ⅲ(1 μg重組PLGF殼聚糖-海藻酸鹽納米粒用生理鹽水稀釋成300 μl)，組Ⅳ為假手術(shù)組(n=5)。大鼠心肌梗死模型建立步驟如下[5]：插管和機(jī)械通氣80次/min，5%異氟烷麻醉。無菌操作下于左胸前區(qū)第四肋間行胸廓切開術(shù)，暴露心臟，撕開心包膜，于左心耳下緣2 mm處用7-0縫合線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。進(jìn)針深度約2 mm(假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎)。導(dǎo)致游離左心室(LV)心肌梗死，隨后心力衰竭。結(jié)扎動(dòng)脈15 min后，27-G針管行3次心肌梗死內(nèi)注射，將物質(zhì)注射至梗塞周圍區(qū)域。定期監(jiān)測(cè)動(dòng)物的體重和死亡率。PLGF殼聚糖-藻酸鹽納米粒經(jīng)心肌內(nèi)遞送至梗塞大鼠心臟的示意圖見圖1。

圖1PLGF殼聚糖-藻酸鹽納米粒經(jīng)心尖原位注射遞送至梗塞大鼠心臟的示意圖

1.2.5 超聲心動(dòng)圖 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)前及術(shù)后2 d、1周、4周及8周，異氟烷麻醉下進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查(2.5%氧氣，500～700 ml/min)，以胸骨旁短軸切面，M超測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)。LVEDD、LVESD以連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量值的平均值作為監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。左心室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100。根據(jù)Teichholz公式[11]計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室舒張末期容積(LVEDV)和左心室收縮末期容積(LVESV)。

1.2.6 疤痕面積分析 術(shù)后8周，處死大鼠后迅速開胸切取心臟，生理鹽水清洗并去除心腔內(nèi)殘余血液，于4%福爾馬林中性緩沖液中固定。保存24 h后經(jīng)石蠟包埋，取5 μm厚的切片行病理組織學(xué)檢查，Masson染色定量測(cè)定疤痕組織(藍(lán)色)。應(yīng)用圖像處理軟件Image J測(cè)量梗死面積并取平均值[12]，梗死面積=(瘢痕內(nèi)弧長+瘢痕外弧長)/(外周長+內(nèi)周長)×100%。

1.2.7 免疫組化檢測(cè)梗死邊緣區(qū)評(píng)估血管生成 采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)大鼠心肌梗死邊緣區(qū)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)陽性的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估新生毛細(xì)血管情況，檢測(cè)抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)陽性平滑肌細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估新生小動(dòng)脈情況。為測(cè)量毛細(xì)血管密度，5處梗死面積成像，對(duì)直徑<10 μm的毛細(xì)血管平均數(shù)計(jì)數(shù)。將毛細(xì)血管密度定量為(總CD31陽性微血管平均數(shù))/mm2，使用3個(gè)組織切片跨越每個(gè)動(dòng)物的梗死周圍組織區(qū)域。小動(dòng)脈密度定量為(總平滑肌肉α-SMA陽性微血管平均數(shù))/mm2。

1.2.8 可溶性細(xì)胞因子的血清濃度 8周后，通過直接心臟穿刺從每只大鼠的左心房收集心臟、血液樣本，14 000 r/min離心10 min，之后將樣品于-20 ℃條件下儲(chǔ)存。按照大鼠鈉尿肽ELISA檢測(cè)試劑盒(CBS-E07972R,CUSABIO,中國)說明書提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行檢測(cè)[13]。

2 結(jié)果

2.1 樣本量和死亡率 35只雌性Lewis大鼠，8只大鼠死亡，死亡率為23%，其中27只大鼠存活至2個(gè)月的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，8只大鼠死亡發(fā)生在第1次冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后48 h。不同群體死亡率差異不明顯，48 h后大鼠無死亡情況。

2.2 納米粒子的表征 透射電鏡分析證實(shí)，PLGF殼聚糖-藻酸鹽納米粒的直徑約100～200 nm(圖2)，球形，“毛絨”表面。粒子正極Zeta電位(7.2±0.5)mV，包封效率38.4%±3.4%。

2.3 體外釋放動(dòng)力學(xué) 體外釋放研究中，在前24 h內(nèi)，藥物釋放有限，但在48 h，由于納米粒隨著時(shí)間的推移逐漸降解，生長因子快速釋放，120 h后無藥物釋放(圖3)。

圖2 PLGF殼聚糖-藻酸鹽納米粒的表征

圖3 PlGF隨時(shí)間變化的體外釋放動(dòng)力學(xué)

2.4 超聲心動(dòng)圖測(cè)量

2.4.1 LVF測(cè)量 心肌梗死前，心肌梗死后注射空納米粒、PLGF及PLGF納米粒后2個(gè)月的大鼠心臟如圖4所示。術(shù)前和心肌梗死后2 d組間LVFS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雙向ANOVA分析顯示，心肌梗死后1周，組間LVFS平均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組Ⅱ與組Ⅲ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(95%CI-4.3～3.9，P>0.05)，組Ⅱ和組Ⅲ高于組Ⅰ；在心肌梗死后4周，組間LVFS平均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組Ⅱ低于組Ⅲ(95%CI-0.3～7.9，P<0.05)，組Ⅱ和組Ⅲ高于組Ⅰ；在梗死后8周，組間LVFS平均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組Ⅱ低于組Ⅲ(95%CI-0.2～8，P<0.05)，組Ⅱ和組Ⅲ高于組Ⅰ。

2.4.2 LVEF測(cè)量 術(shù)前和心肌梗死后2 d，LVEF比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雙向ANOVA分析顯示，心肌梗死后1周，組間LVEF平均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組Ⅱ與組Ⅲ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(95%CI-6.9～5.5，P>0.05)，但是組Ⅱ和組Ⅲ高于組Ⅰ；心肌梗死后4周，組間LVEF平均值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組Ⅱ低于組Ⅲ(95%CI-4.3～16.7，P<0.01)，組Ⅱ和組Ⅲ高于組Ⅰ；在心肌梗死后8周,組間LVEF平均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組Ⅱ低于組Ⅲ(95%CI3.3～15.7，P<0.01)，組Ⅱ和組Ⅲ高于組Ⅰ。見圖4。

2.5 疤痕面積測(cè)量 單向ANOVA分析顯示，心肌梗死8周后組間疤痕面積百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即組Ⅰ與組Ⅱ比較，95%CI0.61～8，P<0.01；組Ⅱ與組Ⅲ比較，95%CI0.2～7.6，P<0.01；組Ⅰ與組Ⅲ比較，95%CI4.5～11.9，P<0.01。見圖5。

圖4 超聲心動(dòng)圖分析心臟功能

圖5 各組急性心臟梗死程度比較

2.6 血管生成測(cè)量 單向ANOVA分析顯示，梗死后8周，組間毛細(xì)血管密度平均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組Ⅰ與組Ⅱ比較，95%CI-66.2～-28.8，P<0.01；組Ⅱ與組Ⅲ比較，95%CI-66.6～-29.2，P<0.01；組Ⅰ與組Ⅲ比較，95%CI-114.1～-76.7，P<0.01(圖6A～圖6C)。每組平均毛細(xì)血管密度如圖6G所示。

在心肌梗死后8周，組間平均小動(dòng)脈密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組Ⅰ與組Ⅱ比較，95%CI-8.6～-2.3，P<0.01；組Ⅱ與組Ⅲ比較，95%CI-6.76～-0.3，P<0.01；組Ⅰ與組Ⅲ比較，95%CI-12.12～-5.8，P<0.01。見圖6D～圖6F。每組平均小動(dòng)脈密度如圖6H所示。

2.7 血清細(xì)胞因子測(cè)量 單向ANOVA分析顯示，在心肌梗死8周后，組間平均細(xì)胞因子水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖7。組間血清TNF-α水平比較：組Ⅰ與組Ⅱ比較，95%CI1.2～7.8，P<0.01；組Ⅱ與組Ⅲ比較，95%CI0.7～7.3，P<0.022；組Ⅰ與組Ⅲ比較，95%CI5.2～11.8，P<0.01)。組間血清IL-6水平比較：組Ⅰ與組Ⅱ比較，95%CI10.3～59.3，P<0.01；組Ⅱ與組Ⅲ比較，95%CI5.8～54.8，P<0.01；組Ⅰ與組Ⅲ比較，95%CI40.6～89.6，P<0.01。組間IL-10比較：組Ⅰ與組Ⅱ比較，95%CI-1.4～-0.04，P<0.01；組Ⅱ與組Ⅲ比較，95%CI-1.5～-0.1，P<0.01；組Ⅰ與組Ⅲ比較，95%CI-2.2～-0.8，P<0.01。

3 討論

心力衰竭最常出現(xiàn)的是缺血性心臟病[14]，血管生成是一種治療缺血性心臟病的新方法，PLGF已在臨床應(yīng)用了近20年。Kolakowski等[15]證明，PLGF直接心肌注射，對(duì)心肌梗死后的心臟有積極影響。本研究中，在比較組Ⅰ和組Ⅱ的LVEF、瘢痕面積和血管生成分析時(shí)得到類似的結(jié)果，本研究通過使用與先前研究相同的PLGF劑量來優(yōu)化蛋白質(zhì)遞送。

圖6 梗死周圍區(qū)域的血管生成和動(dòng)脈生成比較

圖7 梗死后8周各組的血清細(xì)胞因子水平比較

PLGF納米粒的體外釋放時(shí)間數(shù)據(jù)和在4周時(shí)改善的心臟功能情況差異較大，可能的原因是心肌的恢復(fù)時(shí)間。急性心肌梗死后，心肌進(jìn)入冬眠狀態(tài)或所謂的“心肌震顫”。這種異?？梢猿掷m(xù)幾個(gè)星期或幾個(gè)月，并有可能通過血運(yùn)重建[16]。本研究中，血運(yùn)重建通過PLGF注射完成。PLGF納米粒的體外釋放在第5天達(dá)到高峰，而在單獨(dú)注射PLGF的組Ⅱ中，PLGF沒有得到保護(hù)，大部分丟失，組Ⅲ中PLGF受到納米粒保護(hù)持續(xù)釋放5 d。與組Ⅱ比較，組Ⅲ血管生成更多。心肌需要一段時(shí)間才能恢復(fù)，因此,大部分心肌處于冬眠狀態(tài)。結(jié)果表明，與注射空納米粒子或單獨(dú)PLGF比較，PLGF納米粒子遞送增加心臟功能。此外，心肌梗死后，殼聚糖-藻酸鹽納米粒為PLGF提供了持續(xù)一段時(shí)間的緩釋保護(hù)機(jī)制。可以假設(shè)這些納米粒使PLGF免受局部酶促降解，從而延長了生長因子的作用。

LVEF、瘢痕面積和小動(dòng)脈密度的顯著改變伴隨著血清細(xì)胞因子水平的明顯改變。以前的研究集中在MI后細(xì)胞因子的組織表達(dá)，而少數(shù)細(xì)胞因子研究實(shí)際上集中在血清水平的變化[17-18]。因此，我們的研究重點(diǎn)主要是TNF-α、IL-6和IL-10的血清水平。TNF-α和IL-6通過引起重構(gòu)而對(duì)梗死心肌產(chǎn)生負(fù)面影響，而IL-10可以抵消這種影響。與其他組相比，組Ⅲ TNF-α和IL-6促炎細(xì)胞因子的血清水平明顯較低。此外，組Ⅲ IL-10抗炎心臟保護(hù)性細(xì)胞因子的血清水平明顯較高。與其他組比較，組Ⅲ左室重構(gòu)更少，依據(jù)LVESD從基線變化最小，還有瘢痕形成的減少。MI后持續(xù)8周高水平的促炎細(xì)胞因子并不罕見，因?yàn)橹厮苓^程可能會(huì)在MI后持續(xù)數(shù)周或者數(shù)月[18]。此外，研究表明，大鼠血漿TNF-α在MI后2周顯著升高，在8周逐漸達(dá)到峰值[19]。同樣，間充質(zhì)干細(xì)胞通過減少炎癥/抗炎細(xì)胞因子的比例治療心肌重塑[20]。

與急性MI后直接應(yīng)用生長因子比較，納米粒作為PLGF遞送載體的使用導(dǎo)致LV功能、血管密度和抗炎細(xì)胞因子IL-10顯著增加，瘢痕面積形成和促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6顯著減少。因此，可以使用納米粒來提供持續(xù)的緩釋保護(hù)性PLGF治療，增強(qiáng)生長因子在急性心肌缺血情況下的積極作用。此外，這種納米技術(shù)可以用作許多抗心力衰竭藥物的藥物遞送系統(tǒng)。這樣可以將大部分藥物保留在指定區(qū)域，并使全身毒性最小化，但仍需要進(jìn)一步優(yōu)化的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和研究，促進(jìn)新的治療方式產(chǎn)生。