鹽酸昂丹司瓊與牛血紅蛋白之間相互作用的光譜學(xué)研究

庹 潯 俞佳峰 吳 靜 呂小蘭 胡 昱

(南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031)

鹽酸昂丹司瓊(Ondansetron Hydrochloride，簡稱OND)是由葛蘭素史克公司研發(fā)的一種咔唑酮曼尼希堿類止吐藥物。OND是首個上市的強效、高選擇性5-羥色胺3(5-HT3)受體拮抗劑，臨床上主要用于預(yù)防及治療癌癥放化療所引起的惡心嘔吐，并取得良好的效果[1-2]。但是，近年來研究人員發(fā)現(xiàn)OND能夠引起皮膚過敏、癲癇、眩暈等不良反應(yīng)[3-4]，特別值得關(guān)注的是OND可顯著延長QT間期，并因此產(chǎn)生嚴重的心血管不良反應(yīng)[5]。2012年美國食品藥品監(jiān)督管理局因32mg的靜脈用昂丹司瓊注射液有潛在和嚴重的心律失常危險而將其撤市。

OND靜脈注射進入人體后，血液循環(huán)中的蛋白質(zhì)以形成復(fù)合物的方式將OND轉(zhuǎn)運到達靶部位，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。血紅蛋白(Hb)是血液的重要組成部分，能夠運輸氧氣和藥物小分子等物質(zhì)，且Hb的生理功能與其特殊的分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[6]。因此，探究OND與Hb之間的相互作用，不僅有助于了解OND在生物體內(nèi)的循環(huán)、分布和生物活性，而且有助于了解OND對Hb結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的影響，進而理解和推測OND在體內(nèi)運輸過程中對生物體帶來的各種影響。目前，OND與Hb的相互作用的機制尚不清楚。因此，本文在模擬人體生理條件下，運用多種光譜學(xué)以及分子對接技術(shù)研究了OND與牛血紅蛋白(BHb)之間相互作用的機制，擬為有關(guān)OND的藥理學(xué)和毒理學(xué)研究提供一些重要信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光光譜儀(日本日立公司)，測試條件：激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10nm，掃描速度1200nm/min；YJ-501超級恒溫儀(上海躍進醫(yī)療器械廠)；PHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)；UV1870DPC紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器公司)；TENSOR 27紅外光譜儀(德國布魯克公司)。

牛血紅蛋白(BHb，西亞試劑)，配制成1×10-3mol/L的儲備液，用時根據(jù)需要稀釋；鹽酸昂丹司瓊(浙江九州藥業(yè)公司)，配制成濃度為1×10-2mol/L的溶液；pH 7.4含0.15mol/L NaCl的三羥基氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖液(上海藍季科技發(fā)展公司)；實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光實驗

取3ml Tris-HCl緩沖溶液與比色皿中，加入一定量的BHb溶液，并逐次加入一定量的OND溶液，快速混勻后以280nm為激發(fā)波長，分別在溫度為293K、298K、303K的條件下記錄300-400nm波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。固定熒光發(fā)射波長和激發(fā)波長差分別為Δλ=15nm和Δλ=60nm，記錄ODN對BHb同步熒光光譜的影響。

1.2.2 紫外光譜

固定BHb的濃度，并用微量移液器逐次增加體系中ODN的量，以相應(yīng)的ODN溶液做參比，記錄200-300nm波長范圍內(nèi)BHb-OND體系的紫外光譜。

1.2.3 紅外光譜

光譜分辨率4cm-1，掃描范圍1200-1800cm-1，掃描信號累加32次，分別掃描BHb和OND-BHb復(fù)合物的紅外光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 OND對BHb熒光淬滅機理研究

在模擬人體生理條件下，BHb熒光發(fā)射峰的峰高逐漸隨體系中OND量的增加而降低，且最大發(fā)射波長逐漸紅移最終在360nm處出現(xiàn)了一個等發(fā)射點(圖1)，表明OND與BHb形成了一種穩(wěn)定的復(fù)合物，即OND能夠?qū)е翨Hb熒光靜態(tài)淬滅。為了進一步確定OND引起B(yǎng)Hb熒光淬滅的機理，根據(jù)Stern-Volmer方程對BHb的熒光數(shù)據(jù)進行了處理：

(1)

CBHb=8.3×10-7mol/L；曲線1～7：COND=0，1.7，3.3，5.0，6.6，8.3，10(×10-6mol/L)圖1 OND-BHb體系的熒光光譜

式中[Q]為淬滅劑的濃度；F0和F為加入淬滅劑加入前后的熒光強度；Ksv為淬滅常數(shù)；τ0為生物大分子的熒光平均壽命，約為10-8s-1；Kq為雙分子熒光淬滅速率常數(shù)。結(jié)果表明，隨著溫度的增加，Ksv值逐漸降低(表1)，即溫度升高使OND對BHb的動態(tài)淬滅程度降

低，說明OND對BHb的淬滅機制不是由分子之間的擴散和碰撞引起的動態(tài)淬滅，而是OND與BHb形成基態(tài)復(fù)合物的靜態(tài)淬滅過程[7]。各類淬滅劑對生物大分子最大擴散碰撞淬滅常數(shù)為2×1010L·mol-1·s-1，本實驗中不同溫度條件下OND對BHb的淬滅常數(shù)均比其大了兩個數(shù)量級(表1)，從而進一步確認OND對BHb的熒光淬滅過程是靜態(tài)淬滅[6-7]。

對于熒光靜態(tài)淬滅過程，可用Langmuir單分子吸附模型公式：

(2)

對實驗數(shù)據(jù)進行進一步分析，可得到OND-BHb體系的結(jié)合常數(shù)Ka以及結(jié)合位點數(shù)n。由表1所示，在不同溫度條件下n均接近1，表明OND與BHb之間具有一個獨立的結(jié)合位點；Ka值隨著溫度的升高而降低，即溫度越高OND-BHb體系的穩(wěn)定性越低，同樣表明OND對BHb的熒光淬滅機制為靜態(tài)淬滅。

表1 不同溫度條件下OND-BHb體系反應(yīng)常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

2.2 OND與BHb之間的作用力類型

當(dāng)pH為7.4時，BHb整體帶負電(BHb等電點為6.9)，而ODN的游離態(tài)為弱堿性(帶正電)，因此可以推測靜電吸引力在ODN與BHb的結(jié)合過程中發(fā)揮著重要作用。Ross等[8]提出可以根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)判斷小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的作用力類型，其中ΔH>0、ΔS>0主要表現(xiàn)為疏水作用力；ΔH<0、ΔS>0主要表現(xiàn)為靜電作用力；ΔH<0、ΔS<0主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力。因此，本研究通過改變體系的溫度，得到了溫度為293K、298K和303K時OND與BHb之間的結(jié)合常數(shù)Ka值。利用公式3和4計算出OND-BHb體系的熱力學(xué)參數(shù)：

Ln K2/K1=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(3)

ΔG=-RTLnK=ΔH-TΔS

(4)

結(jié)果見表1，ΔG<0表明反應(yīng)是自發(fā)進行的；ΔH<0、ΔS>0，證明OND與BHb之間的作用力主要為靜電作用力。

2.3 OND對BHb構(gòu)象的影響

血紅蛋白的生理功能與其特殊的分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，血紅蛋白結(jié)構(gòu)的改變能夠?qū)е露喾N疾病的發(fā)生。因此，本研究利用紫外光譜、三維熒光光譜、同步熒光光譜和紅外光譜探究OND對BHb構(gòu)象的影響。

OND-BHb體系的紫外光譜譜圖如圖2所示，其中212nm、280nm和405nm處的吸收峰分別反應(yīng)BHb肽鏈骨架、芳香族氨基酸殘基以及血紅素的信息[9]。隨著體系中OND的量的增加，212nm處的的吸收峰逐漸降低且逐漸紅移，表明OND與BHb之間發(fā)生了相互作用并且改變了BHb的α-螺旋含量；280nm處的最大吸收峰降低且明顯紅移，說明芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境極性發(fā)生改變；405nm處吸收峰的位置不變，表明OND并沒有與血紅素輔基發(fā)生直接作用且不能使氧合血紅蛋白發(fā)生脫氧作用[10]。紅外光譜的研究也可以看出OND的加入會導(dǎo)致BHb的酰胺Ⅱ帶(1600-1500cm-1)紅外發(fā)射峰波數(shù)發(fā)生明顯改變，同樣說明OND影響了BHb的空間結(jié)構(gòu)[11]。

如圖3所示，OND的加入導(dǎo)致BHb三維熒光光譜的明顯變化，并且發(fā)射波長整體紅移。同步熒光光譜的研究發(fā)現(xiàn)隨著OND的加入，BHb酪氨酸(Δλ=15nm)和色氨酸(Δλ=60nm)殘基的最大吸收峰強度逐漸降低，且色氨酸殘基的最大吸收波長發(fā)生了明顯的紅移，酪氨酸殘基的最大吸收波長發(fā)生了明顯的藍移，說明結(jié)合過程中OND與酪氨酸和色氨酸之間的距離足夠近并且OND誘導(dǎo)BHb構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖2 OND-BHb體系的紫外光譜(A)和紅外光譜(B)

[BHb]=1.3×10-6 mol/L;[OND]=1.6×10-5 mol/L圖3 BHB(A)與OND-BHb(B)的三維熒光光譜

A:Δλ=15nm; B:Δλ=60nm;COND from 1 to 6;0,1.7,3.3,5.0,6.6 and 8.3(×10-6mol/L)圖4 OND-BHb體系同步熒光圖

3 結(jié)論

本實驗采用多種光譜法技術(shù)探究了OND與Hb之間相互作用的模式和機制。研究的結(jié)果表明靜電作用力在OND-Hb結(jié)合過程中發(fā)揮著主要作用；體系中不同濃度的OND均與BHb在360nm形成一個等發(fā)射點；體系中OND的存在導(dǎo)致Hb的構(gòu)象發(fā)生改變。本實驗的結(jié)果將為有關(guān)秋水仙堿的毒理學(xué)和藥理學(xué)研究提供了重要的信息和理論基礎(chǔ)。