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    高效液相色譜法測定大鼠血漿中木樨草素和牡荊素的含量

    2018-08-31 06:56:50才志陽趙楠郭偉英
    錦州醫(yī)科大學學報 2018年4期
    關鍵詞:木樨牡荊草素

    才志陽,趙楠,郭偉英

    (1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥品管理科;2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院轉化醫(yī)學研究院;3.錦州醫(yī)科大學藥學院藥物分析教研室,遼寧 錦州 121000)

    葎草(humulus scandens)為??浦参锶劜莸娜?,又名勒草、老虎藤。最早見于《唐本草》。植株分布于除新疆、青海以外的大部分地區(qū)。傳統(tǒng)醫(yī)學認為其具有清熱解毒,退熱除蒸,利尿通淋等方面的功效[1-2]。藥用成分主要是葎草總黃酮,包含木樨草素、牡荊素等成分。經過藥理學研究[3-5],發(fā)現(xiàn)葎草總黃酮對于潰瘍性結腸炎具有明顯的抑制作用。

    本實驗以前期藥理學實驗[6]為基礎,進一步探討葎草總黃酮在體內的代謝情況,建立葎草總黃酮體內檢測的高效液相色譜方法,為下一步研究其分子生物學相關機制提供可靠的方法。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    賽里多斯pH儀(北京賽利多斯);Agilent1100(G1314A)高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);RE-52A旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮);Milli-Q Synthesis制水系統(tǒng)(美國Millipore公司);AL204電子天平(上海梅特勒-托利多儀器);TGL-16臺式高速離心機(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)。

    1.2 試藥

    葎草總黃酮結腸定位膠囊(錦州醫(yī)科大學藥物分析教研室制備,經HPLC法測定含有木樨草素1.52 mg/g,牡荊素0.32 mg/g),木樨草素(sigma,批號62696)牡荊素(111K1520),甲醇(天津富宇化工),水為超純水,其余試劑均為分析純。

    1.3 實驗動物

    錦州醫(yī)科大學SD大鼠(動物生產合格證號:SCXK(遼)-2003007),體重(245±15)g,雌雄各半。試驗前禁食12 h自由飲水。

    2 方法與結果

    2.1 色譜條件

    Diamonsil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)進行分析。VWD型檢測器,流動相:甲醇-20 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(58∶42,pH=4.0),流速為1.0 mL/min。進樣量:20 μL,檢測波長在350 nm,柱溫30 ℃。水為超純水。

    2.2 標準溶液的配置

    2.2.1 標準儲備液的制備 分別精密稱取60 ℃減壓干燥8 h的木樨草素與牡荊素對照品適量,置于同一25 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋制成濃度為232.0、99.2 μg/mL的標準儲備液。分別取標準儲備液(見表1)適量并加入流動相,將標準儲備液稀釋2、3、5、10、50、150倍,用于線性范圍、回收率、準確度、精密度和穩(wěn)定性的考察。

    表1 標準儲備液濃度(μg/mL)

    2.2.2 含藥血漿樣品的配制 取標準儲備液分別加入流動相適量,將標準儲備液稀釋6 000、2 000、400、200、120、80、53倍,各取5 μL分別溶于用0.2 mL空白血漿中。用于校準曲線的建立。血漿標準工作溶液(見表2)每天臨用前現(xiàn)配制。

    表2 血漿標準工作溶液濃度

    2.2.3 血漿樣品的處理[7]將0.2 mL 6.0%的高氯酸緩慢加入到0.2 mL空白血漿中,將樣品中的血漿蛋白充分沉淀。用3.0 mL乙酸乙酯渦旋提取木樨草素和牡荊素5 min。3 500 r/min 離心10 min,轉移上清液2.0 mL小心轉移至干凈的尖底離心管中,室溫下在真空干燥器中揮干乙酸乙酯。向殘留物中加入250 μL流動相,12 000 r/min離心10 min,取上清液進樣。

    2.2.4 血漿樣品的采集 大鼠禁食12 h后給予自制結腸定位膠囊,分別在0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 h后采集血液樣本1.0 mL,分別放于含有肝素的5 mL管中,于3 000 r/min分離血漿。以0 h的取樣作為空白血漿,所有血漿樣品的處理方法同2.2.3。

    2.3 方法學考察

    2.3.1 專屬性 實驗色譜條件下,木樨草素和牡荊素分離度良好,理論塔板數(shù)按木樨草素計算不低于4 000,血漿內源性雜質對于分離木樨草素和牡荊素沒有干擾。木樨草素和牡荊素的保留時間約為11.0 min和17.0 min,見圖1。

    2.3.2 線性關系 以木樨草素、牡荊素的峰面積作為縱坐標,以木樨草素、牡荊素的濃度為橫坐標,進行線性回歸分析(見表3和4)。結果表明,鼠血漿中木樨草素和牡荊素校準曲線在38.50~4 350 ng/mL和16.50~1 860 ng/mL范圍內呈線性關系,相應的木樨草素和牡荊素回歸方程分別為y1=0.133 7x+0.541 9(r=0.999 6,n=7),y2=0.110 3x+0.512 5(r=0.999 4,n=7)。

    A:空白血漿色譜圖;B空白血漿中加入1 158 ng/mL木樨草素和495 ng/mL牡荊素的色譜圖;C:給予結腸定位膠囊4 h后的血漿色譜圖(1為木樨草素,2為牡荊素)

    圖1 不同條件下的色譜圖

    表3 木樨草素標準曲線相關數(shù)據(jù)

    表4 牡荊素標準曲線相關數(shù)據(jù)

    2.3.3 方法與絕對回收率考察 取大鼠空白血漿,分別加入木樨草素和牡荊素標準溶液,配制成低,中,高3種濃度(表5)的標準血漿各5批(n=5),按2.2.3的方法進行處理,進行回收率考察。

    2.3.4 重復性與精密度 精確配制高、中、低3個濃度(見表6)的血樣,同日內測定5批,計算日內相對標準差;隔天測定1批,連續(xù)測定5批,計算日間相對標準差。從結果可知日內精密度<7.9%,日間精密度(RSD)<5.4%,見表6。

    表5 回收率考察(n=5)

    表6 木樨草素和牡荊素精密度考察(n=5)

    2.3.5 穩(wěn)定性 精確配制低、高兩種濃度(38.5/16.5ng/mL,4 350/1 860 ng/mL)的血漿樣品,一式3份,放置于3種不同環(huán)境下進行穩(wěn)定性試驗。在短期穩(wěn)定性試驗中,血漿樣品放置于冰箱中(4 ℃),分別于0、2、4、8、12、24 h測定;在長期穩(wěn)定性實驗中,血漿樣品放置于冰柜中(-20 ℃),分別于1、3、7、15、30 d進行測定。結果表明,短期試驗中回收率變化為94%~105.1%(低濃度),95.2%~103.2%(高濃度);長期實驗中回收率變化為97.6%~107.5%(低),95.2%~103.2%(高)。穩(wěn)定性實驗表明:木樨草素和牡荊素血漿樣本在上述情況下穩(wěn)定性良好。

    2.3.6 檢測限及定量限 方法的最低檢測濃度,當信噪比S/N=3時,木樨草素和牡荊素的最低檢測限為1.82和1.94 ng/mL。

    定量限,樣品中被測物能被定量測定的最低量。大鼠血漿中木犀草素和牡荊素的定量限分別為7.84 ng/mL和6.29 ng/mL,RSD分別為6.2%和5.9%。

    3 樣品測定

    給予大鼠口服結腸定位膠囊,按照2.2.4進行血樣采集,測定血漿中木樨草素和牡荊素的濃度(見圖2)。但由于血漿中牡荊素的濃度低于檢測限,只檢測出木樨草素。

    圖2 不同時間點血漿中木樨草素濃度

    4 討 論

    去除血漿樣品中的蛋白質是保證藥物釋出與樣品干凈的重要前提。血漿中的蛋白質沉淀一般采用沉淀劑或利用酶消化法實現(xiàn)。而蛋白質的沉淀效率與介質的pH值和沉淀劑體積有關。在實驗中,分別對乙腈和甲醇的除蛋白效果進行了考察。結果顯示,兩者蛋白沉淀效果不佳,內源性物質對物質的分離干擾較為嚴重。最后采用6%的高氯酸,沉淀效果顯著,干擾分離的內源性物質較少。

    從血漿中萃取分離物質,多采用不同比例的丙酮與醚類,提取的回收率一般在55%、40%[8]。我們通過對木樨草素和牡荊素兩種物質的結構進行分析并結合相似相溶的原理,采用乙酸乙酯進行萃取?;厥章视辛嗣黠@的提升,分別達到了88%和90%。

    流動相的pH對物質的出峰時間和峰形有著巨大影響。當pH>6.0時,出峰時間在17 min以后,峰寬變寬,出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。pH過低,藥物出峰時間前移,但峰形出現(xiàn)分裂,分析認為是藥物形態(tài)影響了峰形。即在一定pH條件下,藥物以分子和鹽的形式存在于流動相中。經過摸索,最終選擇了甲醇20 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(58∶42,pH=4.0)作為流動相,譜圖顯示峰形良好。

    實驗過程中發(fā)現(xiàn),木樨草素和牡荊素的代謝情況表現(xiàn)出了極大的差異性。經查閱有關文獻[9]得知,牡荊素的體內代謝過程中,體內酚的含量會發(fā)生變化,可能是體內某些酚類成份參與了牡荊素的代謝過程??紤]到血漿中木樨草素和牡荊素濃度的差異,推斷兩者具有不同的代謝途徑,參與代謝酶系的活性也有較大的差距。

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