生物可降解鎂合金的全身毒性試驗

甘佼弘 馬 晶 崔志瓊 郭 振 張海娜 張美微 林 欣 王曄玲

(吉林大學第一醫(yī)院心血管疾病診療中心，吉林 長春 130021)

鎂是人體細胞內含量僅次于鉀的必需微量元素之一，是所有金屬材料中密度最接近人體骨密度的金屬，具有理想的力學相容性；且鎂合金表面帶有負電荷，具有低血栓源性和良好的生物相容性〔1〕。其次，鎂離子在人體中參與新陳代謝過程，能激活體內多種酶，參與體內蛋白質的合成、肌肉收縮及體溫調節(jié)。最為重要的是鎂合金具有優(yōu)異的可降解性，可降解生物鎂合金因具有良好的綜合力學性能、生物活性等特征而被譽為最有發(fā)展前景的生物醫(yī)用金屬材料〔2〕。目前，生物可降解鎂合金已作為骨固定材料、多孔骨修復材料、普外科植入支架、口腔科牙種植體材料、心血管可降解鎂合金支架被廣泛研究〔3〕。

經皮冠狀動脈介入(PCI)是目前治療冠心病的主要方法之一〔4〕。而目前臨床上主要使用的金屬支架，因其在體內長期留存不能降解，晚期會出現(xiàn)支架內血栓形成的風險，需要長期給予抗血小板治療，并且能阻礙外科血運重建、側支循環(huán)的形成及血管正性重塑的過程。此外，長期存留于體內的金屬支架作為異物會削弱冠狀動脈的磁共振成像(MRI)或是CT影像。因此，盡早研究出安全有效的生物可降解支架應用于臨床冠脈病變的患者變得尤為迫切。根據(jù)目前研究，生物可降解鎂合金具有良好的彈性形狀記憶功能、物理機械性能及生物相容性〔5〕，同時具有降低支架內急性血栓形成、抑制內皮素的縮血管反應等作用。因此，生物可降解鎂合金被認為是最有前景的用于心血管支架的金屬合金材料〔6〕。本文采用的生物可降解鎂合金是吉林大學工程仿生教育部重點實驗室開發(fā)研制的，根據(jù)國際標準化組織(ISO)對醫(yī)用植入材料的評價標準進行急性、慢性全身毒性試驗，以探究該材料的安全性，為生物可降解鎂合金支架的切割及臨床安全應用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗動物和材料、儀器 (1)Wistar大鼠(吉林大學實驗動物中心)；(2)生物可降解鎂合金Mg-5Sn-1Zn-0.5Ca合金(吉林大學工程仿生教育部重點實驗室)；(3)高壓滅菌機(韓國)；(4)CDULGER型血球計數(shù)儀(美國)；(5)Olympus2700型全自動生化分析儀(日本)。

1.1.2浸提液制備 將生物可降解鎂合金數(shù)枚經清洗、高壓滅菌、烘干后置于無菌培養(yǎng)瓶中，按照ISO文件要求，按試樣表面積/浸體介質為3 cm2/ml的比例加入0.9%的無菌生理鹽水，放置在37℃培養(yǎng)箱中72 h后，得到生物可降解鎂合金浸提液，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1急性全身毒性試驗 取40只清潔級Wistar大鼠，體重120～140 g，雌雄各半，試驗期間給予標準實驗室飲食，不予限量，隨機分成試驗組和對照組(各有10只雌性及10只雄性)，雌雄分籠喂養(yǎng)，記錄每只大鼠的初始體重。按照50 ml/kg的劑量向試驗組大鼠尾靜脈注射生物可降解鎂合金浸提液，注射速度不超過0.1 ml/s，予對照組大鼠注射等量生理鹽水。注射后立即觀察小鼠體內是否出現(xiàn)副作用，并于注射后4、24、48、72 h繼續(xù)觀察小鼠的進食、活動、死亡等一般情況，并記錄體重變化。

1.2.2慢性全身毒性試驗 取清潔級Wistar大鼠80只，體重60～80 g，雌雄各半，隨機分成對照組和試驗組(各有20只雌性及20只雄性)，記錄每只大鼠的初始體重。試驗組進行如下操作：(1)將大鼠以戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后，背部脫毛、消毒，在背部皮下植入生物可降解鎂合金薄片，常規(guī)縫合皮膚。(2)剪去胸部及頸部的鼠毛，然后固定于小手術臺上，切開氣管行氣管插管連接動物呼吸機，設置呼吸頻率為80次/min，潮氣量5～8 ml，吸呼比1∶1，于胸部正中線偏左約1 cm平腋下緣作長約2 cm的縱向切口，鈍性分離各層胸肌及肋間肌，于左側第5、6肋間開胸，但不切斷肋骨，將沾生理鹽水的脫脂薄棉片壓扁后置于心臟及左肺間，充分暴露心尖部，將準備好的生物可降解鎂合金薄片插入心尖部心肌組織內，觀察心臟節(jié)律穩(wěn)定、無活動性出血后，逐層關閉胸腔。大鼠自然清醒后常規(guī)飼養(yǎng)，規(guī)律照明，自由進食及飲水。對照組給予同樣的操作處理，但不植入任何材料，注意無菌操作及術后抗生素使用。植入期間每天觀察大鼠的一般情況，每3 w稱重一次。植入鎂合金3個月和6個月后，每組動物分別取20只(雌雄各半)，采集大鼠血液作血生化及血液常規(guī)指標檢測。分別將大鼠處死解剖，對各臟器稱重并計算臟器指數(shù)，同時對對照組、植入6個月后大鼠心肌及骨骼肌進行組織病理學檢查。取植入鎂合金周圍心肌組織及骨骼肌組織，置入10%中性甲醛固定24 h以上，經乙醇脫水、石蠟包埋成塊后切片染色，在光鏡下觀察其組織病理學改變。

1.3統(tǒng)計學分析 使用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1急性全身毒性反應 對照組及試驗組大鼠均一般情況良好，活動、進食正常，4、24、48、72 h內未觀察到步態(tài)不穩(wěn)、癱瘓、嘔吐、大小便排泄不良、驚厥、呼吸困難、死亡等情況，體重呈增長趨勢。證明生物可降解鎂合金不引起大鼠急性全身毒性反應。

2.2慢性全身毒性反應

2.2.1一般情況 在6個月內，兩組大鼠外觀、一般狀態(tài)、行為活動及飲食情況相同，兩組雄性與雌性大鼠各時間內體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2.2血液常規(guī)檢測 與對照組相比，試驗組3個月和6個月后紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板(PLT)等血液常規(guī)指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總蛋白(TB)、白蛋白(ALB)、血肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)等血生化指標差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2，表3。

表1 生物可降解鎂合金植入后不同時間對雄性、雌性大鼠體重的影響

表2 兩組術后植入生物可降解鎂合金3、6個月后RBC、Hb、WBC、PLT水平比較

表3 兩組術后3、6個月ALT、AST、ALP、GLU、TP、ALB、BUN、Crea水平比較

2.2.3臟器系數(shù)結果 兩組術后3個月和6個月心、肝、肺、腎、睪丸、前列腺、卵巢、子宮各臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

2.2.4病理組織學檢查 術后6個月，兩組鏡下均未見明顯炎癥細胞浸潤，心肌組織、骨骼肌組織細胞形態(tài)基本正常。表明生物可降解鎂合金植入動物體內無慢性全身毒性反應。見圖1。

表4 兩組術后3、6個月，心、肝、肺、腎、睪丸、前列腺、卵巢、子宮等臟器系數(shù)比較

圖1 兩組術后6個月心肌、骨骼肌組織病理組織學改變(HE，×200)

3 討 論

自1977年Gruntzig〔7〕首次應用PCI治療冠狀動脈疾病后，PCI已逐漸成為治療冠心病尤其是急性心肌梗死的主要手段。曾經使用的金屬裸支架與目前廣泛應用的藥物涂層支架是以耐腐蝕金屬為材料制成的永久性支架，病變血管在置入支架后需要6～12個月完成血管重構和內皮愈合〔8〕，而永久性支架在完成支撐作用后不能降解，容易出現(xiàn)血管內皮功能紊亂、局部慢性炎癥、新生組織過度增生、晚期血栓形成等導致支架內再狹窄〔9,10〕。于是人們開始關注生物可降解支架(BDS)的發(fā)展應用。BDS在理論上完成使命支撐作用后會逐漸降解至消失，目前研究中的BDS主要包括可降解鎂合金支架、生物可降解鐵合金支架和可降解聚合物材料支架。然而聚合物材料X線下不顯影，提供支撐力有限，變形能力差〔11〕；鐵合金在生理環(huán)境中腐蝕速度慢，腐蝕產物容易阻塞血管，降解速度慢，故兩者不適用于可降解血管支架〔12〕。因此，可降解鎂合金已成為國內外近些年研究支架材料的新方向。

國內外已開展多項關于可降解鎂合金支架的基礎研究，如將可降解鎂合金支架植入豬或兔的冠狀動脈中，觀察鎂合金支架降解速率及對動脈內膜形成的長期影響，結果顯示支架有良好的生物相容性、極低的血栓栓塞發(fā)生率和炎癥反應〔13,14〕。臨床上已逐漸開始應用可降解鎂合金支架，如植入鎂合金支架治療下肢動脈嚴重缺血的患者及肺動脈閉鎖或主動脈狹窄的新生兒，結果表明鎂合金支架具有良好的支撐作用，無血液和血管方面的毒性反應，植入支架處的血管通暢，與普通支架相比抑制了平滑肌細胞增殖的同時加快了內皮化速度〔15,16〕，但支架降解速度過快，病變血管過早的失去支撐作用，容易造成負性重構導致再狹窄〔17〕。目前通過將包括鋁、鈣、錳、鋅、硅、鋰、鍶、鋯、釔和稀土元素(鈰、鐠、釹、釓、銥)等耐腐蝕的元素加入鎂合金中，降低腐蝕速度，但其安全性及有效性尚未可知〔18〕。

本試驗著重從生物可降解鎂合金的急性全身毒性和慢性全身毒性方面進行了研究。實驗結果提示此可降解鎂合金無明顯生物毒性，未見急性及慢性全身毒性反應，符合醫(yī)學生物材料要求。但是，本實驗對象為動物，與人體存在較大的差異，且仍需進一步驗證其熱原、細胞毒性、溶血、皮內反應、致敏反應、遺傳毒性等。同時，鎂合金的性能對生物可降解鎂合金支架的加工成型技術來說至關重要。因此，將生物可降解鎂合金作為心血管支架安全有效地應用于臨床，還需進行大規(guī)模深入系統(tǒng)的研究。