甲狀腺癌患者癌組織中CD34、增殖細(xì)胞核抗原和內(nèi)皮細(xì)胞特異分子-1的表達(dá)及意義

李 銳 李曉麗

(吉林省人民醫(yī)院病理科，吉林 長春 130021)

甲狀腺癌近年來發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病因素及發(fā)病機(jī)制成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)〔1〕。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、轉(zhuǎn)移可能與多種癌基因、抑癌基因有關(guān)，也可能與多種炎性因子相關(guān)，因此腫瘤發(fā)病機(jī)制是一種多因素的生物學(xué)行為〔2,3〕。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)CD34、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、內(nèi)皮細(xì)胞特異分子(ESM)-1在甲狀腺癌組織、甲狀腺癌旁正常組織中的蛋白含量、mRNA水平及蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度，探究其與甲狀腺癌預(yù)后及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為甲狀腺癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1臨床資料和實(shí)驗(yàn)分組 選取2016～2018年吉林省人民醫(yī)院病理科確診住院手術(shù)甲狀腺癌患者作為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為兩組：甲狀腺癌組織81例，男36例，平均年齡(56.3±2.1)歲，女45例，平均年齡(58.2±2.6)歲；甲狀腺癌旁正常組織28例，男10例，平均年齡(56.9±2.7)歲，女18例，平均年齡(58.3±2.9)歲。甲狀腺癌依據(jù)臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期56例、Ⅲ～Ⅳ期25例；依據(jù)病理分型，高分化31例、中分化36例、低分化14例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例。所有研究對(duì)象無其他臟器的病變，具有可比性(P>0.05)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 烘干烤箱(上海儀器設(shè)備廠)，萊卡切片機(jī)(德國，Leica2245)，包埋機(jī)和撈片機(jī)(德國，Leica2245)，移液器(芬蘭)，OLYMPUS BX51光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)，7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Epoch酶標(biāo)儀(美國ABI公司)。兔抗CD34、PCNA、ESM-1抗體由北京鼎國生物有限公司提供；SP9710和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒由福州邁新生物有限公司提供；圖像分析軟件由廈門Motic公司提供。Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購于塔克拉公司；CD34、PCNA、ESM-1酶聯(lián)免疫試劑盒購于長春鼎國生物有限公司。

1.3檢測(cè)指標(biāo) 取術(shù)后甲狀腺癌組織和甲狀腺癌旁正常組織，一部分凍存待測(cè)，一部分固定于10%的甲醛液中24 h，進(jìn)行修塊、脫水、浸蠟、包埋。

1.3.1CD34、PCNA、ESM-1蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度的檢測(cè) 組織切片成3 μm，每個(gè)樣本3片，80℃烤箱烘烤3 h，常規(guī)脫蠟至水，采用檸檬酸抗原修復(fù)液煮沸10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，分別滴加CD34、PCNA、ESM-1抗體(1∶300稀釋比例)，進(jìn)行CD34、PCNA、ESM-1免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，操作嚴(yán)格依據(jù)SP試劑盒說明書。

1.3.2CD34、PCNA、ESM-1蛋白含量的檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰浴中研磨組織制備勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)，操作嚴(yán)格依據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3兩組樣本中CD34、PCNA、ESM-1 mRNA水平的檢測(cè) 引物的設(shè)計(jì)和合成由上海生物工程有限公司提供，Trizol提取總RNA然后行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)，每個(gè)樣本基因擴(kuò)增3次取樣本均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CD34、PCNA、ESM-1在甲狀腺癌、甲狀腺癌旁正常組織中蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度、蛋白含量及mRNA水平的比較 與甲狀腺癌旁正常組織比較，CD34、PCNA、ESM-1在甲狀腺癌組織中的蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)，蛋白含量及mRNA水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2CD34、PCNA、ESM-1在甲狀腺癌中的陽性表達(dá)率與甲狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系 CD34、PCNA、ESM-1在甲狀腺癌組織中的陽性表達(dá)率隨甲狀腺癌臨床分期逐級(jí)遞增，隨病理分級(jí)高、中、低分化依次遞增，隨無、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移依次遞增，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表1 CD34、PCNA、ESM-1在甲狀腺癌、癌旁正常組織中蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度、蛋白含量及mRNA水平的比較

與癌旁正常組織比較：1)P<0.05

臨床特征nCD34+-陽性率(%)PCNA+ -陽性率(%)ESM-1+-陽性率(%)臨床分期 Ⅰ～Ⅱ563422 60.71 35 2162.5031 25 55.36 Ⅲ～Ⅳ25214 84.001) 22 3 88.001)20 580.001)病理分級(jí) 高分化311615 51.61 17 14 54.8314 1745.16 中分化362610 72.222)26 10 72.222)25 1169.442) 低分化1413 192.863)140100.003)12 2 85.713)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無 623824 61.2938 2461.2935 27 56.45 有 1917289.474)19 0 100.004)16 384.214)

與Ⅰ～Ⅱ 期比較：1)P<0.05；與高分化比較：2)P<0.05;與中分化比較：3)P<0.05；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較：4)P<0.05

3 討 論

甲狀腺癌是發(fā)病率增速最快的腫瘤之一，同時(shí)它也是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的腫瘤〔3〕。由于甲狀腺癌的發(fā)病率增速快及復(fù)發(fā)率高，對(duì)甲狀腺癌患者術(shù)后提供相應(yīng)的靶向治療尤為重要，以便對(duì)預(yù)后給予準(zhǔn)確預(yù)判，提高患者的生存率及生存質(zhì)量。

以往研究〔4,5〕多從與甲狀腺腫瘤相關(guān)的多種癌基因、抑癌基因及炎性因子著手，本實(shí)驗(yàn)側(cè)重于腫瘤內(nèi)的微血管、內(nèi)皮細(xì)胞因子及增殖細(xì)胞核抗原的研究，觀察血液供應(yīng)與甲狀腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

CD34(人類造血干細(xì)胞抗原)起源于間質(zhì)，是高原糖基化的跨膜糖蛋白，是血管內(nèi)皮分化的標(biāo)志物，特異度較高，能通過微血管密度反映腫瘤微血管的生成狀況〔6,7〕。PCNA存在于細(xì)胞核內(nèi)且在細(xì)胞核內(nèi)合成，細(xì)胞周期中反映DNA的復(fù)制、合成狀態(tài)，因此僅在增殖細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，是判斷腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志物及良好指標(biāo)〔8,9〕。

ESM-1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是一種可溶性的糖蛋白，在許多惡性腫瘤中都呈高表達(dá)狀態(tài)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)，其表達(dá)受多種因素調(diào)控，是腫瘤內(nèi)皮組織血管侵襲的標(biāo)志物〔10,11〕。

綜上所述，CD34、PCNA、ESM-1在甲狀腺癌組織的高表達(dá)反映了癌組織血液供應(yīng)的豐富，提示甲狀腺癌患者術(shù)后進(jìn)行CD34、PCNA、ESM-1聯(lián)合檢測(cè)，有助于判斷癌癥患者的預(yù)后、轉(zhuǎn)移，并開展針對(duì)性的靶向治療。