液基細(xì)胞制片聯(lián)合巴氏染色觀察實(shí)體瘤腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液中腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

龐曉川 李 琳 王永香 潘振宇

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長春 130021)

腦膜轉(zhuǎn)移也稱腦膜癌病或癌性腦膜炎，指腫瘤細(xì)胞侵入蛛網(wǎng)膜下腔腦脊液中，彌漫浸潤軟腦膜或蛛網(wǎng)膜(柔腦膜)〔1〕。實(shí)體瘤腦膜轉(zhuǎn)移既往被認(rèn)為是一種罕見的致死性并發(fā)癥。隨著惡性腫瘤治療效果改善，患者生存期延長，包括腦膜轉(zhuǎn)移在內(nèi)的遠(yuǎn)地轉(zhuǎn)移發(fā)生率隨之增加。全身化療藥物廣泛應(yīng)用，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)成為腫瘤細(xì)胞最終的避風(fēng)港。近年來，腦膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯上升。由于本病造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌漫受累，癥狀復(fù)雜多樣，影像學(xué)檢查缺少特異性，診斷困難。腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查找到惡性細(xì)胞是腦膜轉(zhuǎn)移診斷的特異性標(biāo)準(zhǔn)〔1〕。由于既往診斷的病例數(shù)有限，且傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)對細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)顯示欠佳，細(xì)胞學(xué)檢查往往被用于良惡性的判定〔2〕，而腦膜轉(zhuǎn)移患者原發(fā)腫瘤的病理類型仍主要依靠組織學(xué)檢查。目前認(rèn)為，約有10%的腦膜轉(zhuǎn)移患者既往無腫瘤病史〔1〕。近年來，常見以腦膜轉(zhuǎn)移起病，原發(fā)灶隱匿或難以判定的患者〔3～5〕。

采用免疫化學(xué)法定性細(xì)胞來源的方法往往需要聯(lián)合多種免疫標(biāo)記物。然而，不同于胸腹水標(biāo)本，腦脊液取材標(biāo)本量有限，難以保存；絕大部分標(biāo)本缺少足夠細(xì)胞數(shù)量以離心出細(xì)胞球，進(jìn)行固定包埋。這使得免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測腦脊液中腫瘤來源及類型的應(yīng)用受限，并不被廣泛應(yīng)用〔6,7〕。另外，早有研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液免疫細(xì)胞化學(xué)法較常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法未能增加檢查的敏感性，不作為腦膜轉(zhuǎn)移診斷的推薦檢測項(xiàng)目〔7～9〕。目前，基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的細(xì)胞學(xué)檢查仍是實(shí)體瘤腦膜轉(zhuǎn)移的主要細(xì)胞學(xué)檢查方法。

液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)是細(xì)胞病理學(xué)技術(shù)的重大進(jìn)展，其采用流體力學(xué)原理及高精密過濾膜進(jìn)行細(xì)胞采集，電化學(xué)技術(shù)使細(xì)胞向玻片上自然吸附，不僅可充分收集標(biāo)本中的細(xì)胞成分，且對細(xì)胞無明顯擠壓等外力作用。整個(gè)制片及固定過程均保持了原有液態(tài)環(huán)境，降低細(xì)胞暴露于空氣發(fā)生退變、損傷的概率。既往研究認(rèn)為〔10～12〕，此方法適用于惡性實(shí)體腫瘤腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查，且利于腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與分析。本文通過觀察采用此技術(shù)進(jìn)行腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查陽性的標(biāo)本，總結(jié)不同病理類型腫瘤細(xì)胞形態(tài)特征表現(xiàn)，希望對提高腦脊液腫瘤細(xì)胞診斷水平有所幫助。

1 材料與方法

1.1研究對象 回顧吉林大學(xué)第一醫(yī)院2009年9月至2014年5月收治的采用液基細(xì)胞制片聯(lián)合巴氏染色的腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查方法獲得細(xì)胞學(xué)診斷的惡性腫瘤腦膜轉(zhuǎn)移患者。排除神經(jīng)源性及血液系統(tǒng)來源惡性腫瘤，排除原發(fā)灶來源診斷不明患者，共81例患者入組。女42例，男39例，年齡37～ 72歲(中位年齡54歲)。其中，68例患者既往有惡性腫瘤史，包括肺腺癌29例、肺鱗癌1例、肺小細(xì)胞癌14例、肺大細(xì)胞癌1例、乳腺癌17例、胃腺癌3例、乳腺及肺雙重癌1例，肝細(xì)胞癌1例，喉鱗癌1例；其余13例以腦膜轉(zhuǎn)移為首發(fā)，進(jìn)一步檢查診斷肺腺癌9例，胃黏液腺癌2例，肺小細(xì)胞癌1例，原發(fā)顱內(nèi)惡性黑色素瘤1例。除原發(fā)中樞惡性黑色素瘤外，其余患者均有組織學(xué)病理檢查證實(shí)。按照細(xì)胞病理類型分為6類，腺癌60例、鱗癌2例、小細(xì)胞癌16例、大細(xì)胞癌1例、肝細(xì)胞癌1例、惡性黑色素瘤1例。

1.2腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查 全部腦脊液標(biāo)本來源于患者治療前的腰穿術(shù)，檢查次數(shù)為1～4次，單次采集標(biāo)本量6～12 ml。采集后需立即送檢，盡早進(jìn)行標(biāo)本制片處理。

采用液基制片聯(lián)合巴氏染色的細(xì)胞學(xué)檢查方法：標(biāo)本采集后加入10 ml PreservCyt細(xì)胞保存液混合，靜置15 min以上；使用新柏氏2000液基細(xì)胞自動(dòng)制片機(jī)制片；95%乙醇固定15 min；常規(guī)巴氏染色。

1.3閱片，總結(jié)及分析細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 所有標(biāo)本由3名細(xì)胞病理專業(yè)醫(yī)生鏡下閱片。根據(jù)患者組織學(xué)檢查確定的腫瘤病理類型進(jìn)行分類，總結(jié)分析不同類型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)，主要包括細(xì)胞一般形態(tài)及分布、胞質(zhì)、核、染色質(zhì)、核仁及細(xì)胞內(nèi)特殊結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)特點(diǎn)。

2 結(jié) 果

顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖1)，90%以上標(biāo)本制片染色效果滿意，雜質(zhì)少，細(xì)胞退變少，可以清楚觀察細(xì)胞形態(tài)?？偨Y(jié)分析不同類型惡性細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)(表1)，腺癌細(xì)胞：細(xì)胞體積明顯增大，多呈圓形或橢圓形，散在或團(tuán)簇分布；胞質(zhì)深染，部分含有空泡；單核或多核，核質(zhì)比多明顯增大，也可較小，居中或偏位；染色質(zhì)多為不均勻團(tuán)片狀深染，部分有細(xì)顆粒感；多有紅染或藍(lán)黑深染核仁，大小不一，數(shù)目不定；偶可見病理性核分裂象、胞質(zhì)橋、細(xì)胞吞噬等表現(xiàn)。鱗癌細(xì)胞：體積較大，圓形或不規(guī)則形，散在或團(tuán)簇分布；部分角化胞質(zhì)為粉紅色，伴細(xì)胞核縮?。欢鄦魏?，核質(zhì)比明顯增大；染色質(zhì)呈棉絮或顆粒樣深染；大部分細(xì)胞核內(nèi)具有多個(gè)紅染核仁，多位于細(xì)胞核周邊。小細(xì)胞癌：多團(tuán)簇分布，細(xì)胞體積相對其他腫瘤細(xì)胞較??；單核，核質(zhì)比極大，似裸核；染色質(zhì)粗顆粒樣深染；未見明確核仁。大細(xì)胞癌：散在或小簇分布，體積大，邊界欠清；多單核；染色質(zhì)粗顆粒樣深染；未見明顯核仁。肝細(xì)胞癌：散在分布，體積大，形態(tài)規(guī)整，邊界清楚；胞質(zhì)均勻深染，部分胞質(zhì)中可見點(diǎn)狀顆粒結(jié)構(gòu)；染色質(zhì)均勻深染，缺少顆粒感；大部分細(xì)胞核內(nèi)可見單一圓形鮮紅色核仁，體積大，多位于細(xì)胞核中央。惡性黑色素瘤：體積大，圓形，散在或小簇分布；胞膜有環(huán)周的偽足樣突起；單核；核中央可見單一紅色核仁，邊界不清，體積較大；核或胞質(zhì)中可見大小不等黑色塊狀物質(zhì)。

表1 腦脊液中不同類型腫瘤細(xì)胞顯微鏡下特點(diǎn)

續(xù)表1 腦脊液中不同類型腫瘤細(xì)胞顯微鏡下特點(diǎn)

A～H：腺癌；I、J：鱗癌；K：小細(xì)胞癌；L、M：大細(xì)胞癌；N、O：肝細(xì)胞癌；P：惡性黑色瘤圖1 腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查(液基制片，巴氏染色，× 400)

3 討 論

正常腦脊液細(xì)胞成分相對簡單，腫瘤細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)明顯區(qū)別于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等固有的細(xì)胞成分。因此，腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查對于非血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的定性具有高度特異性〔2,6〕。惡性細(xì)胞的判定主要依靠細(xì)胞形態(tài)區(qū)別于腦脊液中正常細(xì)胞，并具有顯著惡性特征。目前被廣泛認(rèn)可的細(xì)胞惡性形態(tài)學(xué)特征包括〔13〕：明顯超過正常腦脊液細(xì)胞體積的異常大細(xì)胞；異常細(xì)胞間大小不一，多形性；細(xì)胞深染；核質(zhì)比增大；多核、核不規(guī)則或有角狀突起；核染色質(zhì)深染、染色不均；多核仁；病理性核分裂象、胞質(zhì)橋等。既往的細(xì)胞學(xué)檢查方法，可以觀察到以上惡性特征，并進(jìn)行定性診斷，但多難以清楚觀察到更加細(xì)致的形態(tài)結(jié)構(gòu)，無法進(jìn)行細(xì)胞分類〔6,14〕。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)〔13,15,16〕，腦脊液標(biāo)本采集量少(<10.5 ml)，采集后未能及時(shí)制片處理(>90 min)，以及標(biāo)本制片固定的過程中細(xì)胞暴露于空氣中時(shí)間較長，是造成細(xì)胞退變、形態(tài)破壞、難以觀察的主要因素。采用液基細(xì)胞制片技術(shù)的細(xì)胞學(xué)檢查方法，可在技術(shù)上改善腦脊液中腫瘤細(xì)胞的保護(hù)，減少空氣暴露，減少細(xì)胞退變，提高檢出率〔12〕。本研究認(rèn)為，液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)在腦脊液腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察方面具有明顯優(yōu)勢。腫瘤細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的清晰顯示，不僅幫助細(xì)胞性質(zhì)的判定，并能針對不同病理類型腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特征性表現(xiàn)的分析總結(jié)，使我們能夠?qū)δX脊液腫瘤細(xì)胞的病理類型進(jìn)行判斷。

巴氏染色法早已被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤等上皮來源惡性腫瘤的細(xì)胞學(xué)檢查染色中具有明顯優(yōu)勢〔17〕。實(shí)體腫瘤中以上皮來源惡性腫瘤為主，其腦脊液標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞染色適合采用巴氏染色法。本組標(biāo)本中，巴氏染色多將腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)染為藍(lán)色或藍(lán)綠色，核染色質(zhì)染為藍(lán)紫色或藍(lán)黑色，核仁多為紅色。胞質(zhì)、核染色質(zhì)及核仁等不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)間顏色對比鮮明，便于觀察。液基細(xì)胞制片聯(lián)合巴氏染色充分集合了細(xì)胞保護(hù)與形態(tài)結(jié)構(gòu)顏色鮮明的特點(diǎn)，良好顯示了細(xì)胞原有特征。染色質(zhì)及核仁的顯示細(xì)膩、清晰，是此方法的重要優(yōu)勢。

不同病理類型的腫瘤細(xì)胞具有不同的形態(tài)特征，這些特征主要表現(xiàn)在細(xì)胞核、染色質(zhì)、核仁等細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的差異。腦膜轉(zhuǎn)移最多見的細(xì)胞類型為腺癌，其結(jié)構(gòu)形態(tài)最為多樣，缺乏特征性，可能是由于原發(fā)腫瘤來源于多種不同器官所致。腺癌細(xì)胞核染色質(zhì)多為不均勻團(tuán)片狀深染，部分具有顆粒感，這種顆粒感相對小細(xì)胞癌及大細(xì)胞癌較為細(xì)膩；也可見泡沫樣或棉絮樣胞質(zhì)；多有核仁，大小不一，數(shù)目不定，核仁體積多小于肝細(xì)胞癌、大于鱗癌；部分胞質(zhì)內(nèi)可見空泡，具有一定特征性；偶可見多種異常核分裂象、胞質(zhì)橋、細(xì)胞吞噬及細(xì)胞單層上皮樣排布，這些表現(xiàn)未出現(xiàn)于其他腫瘤細(xì)胞標(biāo)本。鱗癌細(xì)胞核內(nèi)?？梢姸鄠€(gè)細(xì)小紅染核仁，并多位于核周邊；部分角化胞質(zhì)均勻粉染，細(xì)胞核縮小，核漿比減小，核仁顯示不清為其主要特征。小細(xì)胞癌及大細(xì)胞癌細(xì)胞染色質(zhì)呈粗顆粒樣深染，多單核，核漿比極大，似裸核，為其主要特征；二者間比較，小細(xì)胞癌體積明顯小于大細(xì)胞癌，且小細(xì)胞癌多為團(tuán)簇分布，未見多核及核仁；部分大細(xì)胞癌細(xì)胞核內(nèi)可見圓形細(xì)小核仁。肝細(xì)胞癌具有較多特征性，染色質(zhì)均勻深染，缺少顆粒感；核內(nèi)多有單個(gè)大體積單個(gè)核仁，多位于細(xì)胞核中央。惡性黑色素瘤細(xì)胞具有明顯特征性，易于鑒別：細(xì)胞周邊明顯的環(huán)周偽足突起；核中央可見單個(gè)且邊界不清紅色核仁，體積較大；核或胞質(zhì)中可見大小不等黑色顆粒物質(zhì)。

腦脊液中罕見鱗癌、大細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌等，既往缺少此類細(xì)胞在腦脊液中的形態(tài)學(xué)觀察報(bào)道。本研究中鱗癌、大細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌等患者數(shù)量少，故根據(jù)現(xiàn)有的資料總結(jié)分析出的相應(yīng)特征表現(xiàn)可能并不全面。希望隨著腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)設(shè)備的進(jìn)步，觀察及研究的深入，將會有更加全面而系統(tǒng)的腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析及分類標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)實(shí)體腫瘤腦膜轉(zhuǎn)移的腦脊液細(xì)胞學(xué)診斷取得新的發(fā)展。