miR-127-3p通過下調(diào)靶基因MAPK4抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的機制研究

顏洋 韓美文 汪應(yīng)瑞

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Glioma)起源于外胚層中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的致死性惡性腫瘤，約占顱內(nèi)惡性腫瘤的50%[1]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤好發(fā)于成人，腫瘤細(xì)胞呈彌漫性生長、侵襲性高、無明確邊界，神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的5年生存率低于10%，嚴(yán)重危害人類生命健康[2-3]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)特性是導(dǎo)致臨床上神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者治療困難的根本原因之一[4]，因此深入研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因遺傳學(xué)改變特點及尋找可能的基因治療靶點，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和治療具有重大意義。近年來，微小RNA(miRNA)在人類多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和機制逐漸得到人們的重視。已經(jīng)明確多種miRNA同樣參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物行為學(xué)的調(diào)控。

miR-127與miR-136、miR-432等同屬1個miRNA簇，位于人類染色體14q32.31上，其前體基因可表達為miR-127-3p和miR-127-5p兩種成熟的miRNA[5]。miR-127可能對腫瘤起著抑制作用，如miR-127在前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌等多種癌癥中表達下調(diào)，miR-127能通過靶基因COA1和PDIA6抑制巨細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞(GCTSC)的增殖[6]。多項研究表明，miR-127在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中呈低表達[7-8]，但miR-127在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的調(diào)控作用尚不清楚。本研究擬探討miR-127對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的生物學(xué)作用及其可能的靶基因，以期為神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例收集 收集2013年3月-2016年9月本院17例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者和15例健康人群腦脊液，所有患者及健康人群均簽署知情同意書，將穿刺獲取的腦脊液快速置于液氮保存，以備后續(xù)檢測所用。本實驗部分獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)實施。神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南(2015)》[9]；②所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 復(fù)發(fā)病例；② 保守治療患者；③ 合并有嚴(yán)重心、肺、肝、腎等臟器嚴(yán)重?fù)p壞患者。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U373、U87、SHG44和人腦正常膠質(zhì)細(xì)胞株HEB購自中科院，DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、MTT試劑、DMSO、凋亡試劑盒等材料均購于碧云天生物有限公司，Lipofectatime 2000(Invitrogen產(chǎn)品)、miR-127-3p mimics和陰性對照物、野生型和突變型MAPK4基因3′UTR熒光素酶表達載體等均購于廣州銳博生物有限公司。Trizol試劑(Invitrogen)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)、PCR試劑盒(TOYOBO)等購自上海吉馬公司，蛋白制膠試劑盒、PVDF膜、電泳等所用化學(xué)分析試劑均購于武漢谷歌生物有限公司。兔抗人一抗(Bcl-2、Caspase-3、MAPK4)和山羊抗兔IgG二抗 (HRP)均購于武漢三鷹公司。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U373、U87、SHG44均采用DMEM(含有胎牛血清和雙抗)培養(yǎng)，人腦正常膠質(zhì)細(xì)胞株HEB采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含有胎牛血清和雙抗)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃和5%CO2。取U251做瞬時轉(zhuǎn)染，當(dāng)U251細(xì)胞匯合率達到60%～70%時根據(jù)說明書加入轉(zhuǎn)染試劑、miR-127-3p mimics或陰性對照物進行瞬時轉(zhuǎn)染，24 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)并完成下一步實驗。

1.3 MTT實驗 將人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251種植于96孔板中，根據(jù)轉(zhuǎn)染miR-127-3p mimics水平設(shè)置3個實驗組：50組(轉(zhuǎn)染水平為50 nmol/L)、100組(轉(zhuǎn)染水平為100nmol/L)、150組(轉(zhuǎn)染水平為150 nmol/L)，并設(shè)置對照組(轉(zhuǎn)染miR-127-3p的陰性對照物)。每組設(shè)置5個復(fù)孔。以轉(zhuǎn)染的時間為起點(0 h)，分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h采用MTT實驗檢測各組細(xì)胞的增殖。MTT檢測簡要概括如下：培養(yǎng)結(jié)束后在每孔中加入20 mL的5 mg/L的MTT試劑，置于37 ℃中孵育4 h，然后吸去培養(yǎng)基，每孔中加入150 mL的DMSO試劑，室溫避光條件下置于振蕩器上震蕩10 min，然后在酶標(biāo)儀上上機檢測，測定570nm波長處的吸光度值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡 各組細(xì)胞在6孔板中轉(zhuǎn)染結(jié)束后吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗1遍，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集單細(xì)胞懸液，用PBS清洗2遍。按照碧云天Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書1次加入試劑，采用流式細(xì)胞儀上機檢測各組細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡情況。

1.5 熒光定量PCR Trizol法提取組織或者細(xì)胞的總RNA，檢測RNA質(zhì)量，進行Poly加尾處理，采用TOYOBO公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后采用TOYOBO公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix上機(實時熒光定量PCR儀，ABI7500，美國)進行熒光定量PCR檢測。miR-127-3p以U6作為內(nèi)參。miR-127-3p上游引物5′-GGAAGATCTGTAGTCCTGTCTGTTGGTCAG-3′，下游引物5′-CCCAA GCTTCCTGAAGAACTGCTTCCGCC-3′， U6上游引物5′-GCTTCGGCA CATATACTAAAAT -3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。2-△△Ct法計算每個樣的mRNA相對表達水平。

1.6 蛋白印跡實驗檢測蛋白水平 采用RIPA試劑裂解并提取細(xì)胞總蛋白，采用碧云天BCA試劑盒測定蛋白水平，加上樣緩沖液，100 ℃下蛋白變性，每孔上樣量為20 μg，SDS-PAGE法電泳，電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜，將蛋白通過電轉(zhuǎn)到PVDF膜上；5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗脫3遍，孵一抗過夜，TBST洗脫3遍，孵二抗2 h，TBST洗脫3遍，最后在暗室中在X線膠片上顯影和定影，然后進行蛋白半定量灰度值分析。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?采用在線靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan、miRanda預(yù)測miR-127-3p的靶基因，結(jié)合已發(fā)表的文獻研究，確立MAPK4為miR-127-3p的可能靶基因。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證。構(gòu)建突變型和野生型MAPK4基因3′UTR熒光素酶表達載體(MUT-3′UTR、WT-3′UTR)，并將其分別與miR-127-3p mimic或miR-127-3p陰性對照物，采用Lipofectatime 2000共同轉(zhuǎn)染入U251細(xì)胞，通過熒光素酶報告基因檢測儀檢測各組細(xì)胞熒光素酶的活性來鑒定MAPK4是否為miR-127-3p的直接作用靶點。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-127-3p在腦脊液中的表達水平

神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者(1.33±0.12)腦脊液中的miR-127-3p相對表達水平低于健康人群(3.62±0.26)(t=5.867，P=0.004)。

2.2 miR-127-3p在細(xì)胞系中的表達水平

U251(0.59±0.05)、U373(0.96±0.08)、U87(0.77±0.03)、SHG44(1.28±0.05)中miR-127-3p相對表達水平均低于人腦正常膠質(zhì)細(xì)胞株HEB(3.64±0.26)(P均<0.01)，其中U251細(xì)胞株中miR-127-3p相對表達水平最低。

2.3 miR-127-3p抑制U251細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染后24、48、72 h150組、100組和50組細(xì)胞吸光度值均低于對照組(P均<0.05)，并且隨著miR-127-3p mimics轉(zhuǎn)染水平增高，U251細(xì)胞吸光度值越低(圖1)。

圖1 MTT實驗檢測各組細(xì)胞增殖 對照組為轉(zhuǎn)染miR-127-3p陰性對照物;50組為轉(zhuǎn)染50 nmol/L 的miR-127-3p mimics;100組為轉(zhuǎn)染100 nmol/L的miR-127-3p mimics;150組為轉(zhuǎn)染150 nmol/L 的miR-127-3p mimics;與同時間點對照組比較,*P<0.05

2.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡

miR-127-3p mimics轉(zhuǎn)染組(39.3±4.6%)細(xì)胞早期凋亡率高于對照組(7.2±0.6%)(P<0.05)；miR-127-3p mimics轉(zhuǎn)染組(9.3±2.3%)細(xì)胞晚期凋亡率高于對照組(2.4±0.5%)(P<0.05)(圖2)。

圖2 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡 對照組為轉(zhuǎn)染miR-127-3p陰性對照物;Mimic組為轉(zhuǎn)染150 nmol/L的miR-127-3p mimics

2.5 miR-127-3p調(diào)控U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax和Mcl-1表達水平

mimic轉(zhuǎn)染組(0.269±0.008)U251細(xì)胞bcl-2蛋白表達水平低于對照組(0.556±0.039)，mimic轉(zhuǎn)染組(0.314±0.015)U251細(xì)胞bax蛋白表達水平高于對照組(0.086±0.006)，mimic轉(zhuǎn)染組(0.144±0.009)U251細(xì)胞Mcl-1蛋白表達水平低于對照組(0.426±0.028)(P均<0.05)(圖3)。

2.6 miR-127-3p靶基因預(yù)測和驗證

采用在線靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan、miRanda預(yù)測miR-127-3p的靶基因為MAPK4，MAPK4 mRNA 3′UTR與人miR-127-3p結(jié)合區(qū)域如圖4所示。本研究根據(jù)預(yù)測結(jié)合區(qū)域序列構(gòu)建了MAPK4-WT-3′UTR和MAPK4-MUT-3′UTR。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，只有當(dāng)MAPK4-WT-3′UTR與miR-127-3p mimic共同轉(zhuǎn)染時熒光素酶活性被抑制，這提示miR-127-3p能與MAPK4直接結(jié)合(圖5)。

圖3 Western blot檢測細(xì)胞蛋白表達水平 對照組為轉(zhuǎn)染miR-127-3p陰性對照物;Mimic組為轉(zhuǎn)染150 nmol/L 的miR-127-3p mimics;a為Western blot實驗蛋白條帶圖;b為Western blot實驗蛋白條帶灰度值比,與對照組比較,*P<0.05

圖4 miR-127-3p與靶基因結(jié)合位點序列圖

圖5 雙熒光素酶報告實驗 mimic為miR-127-3p mimics;mimic-ctrl為miR-127-3p 陰性對照組;WT-3'UTR為野生型MAPK4基因3'UTR熒光素酶表達載體;MUT-3'UTR為突變型MAPK4基因3'UTR熒光素酶表達載體

2.7 miR-127-3p mimic下調(diào)U251細(xì)胞MAPK4蛋白表達水平

miR-127-3p mimic轉(zhuǎn)染組(0.121±0.003)U251細(xì)胞MAPK4蛋白表達水平低于對照組(0.467±0.028)(P<0.05)(圖6)。

圖6 Western blot實驗檢測細(xì)胞MAPK4蛋白條帶 對照組為轉(zhuǎn)染miR-127-3p陰性對照物;Mimic組為轉(zhuǎn)染150 nmol/L的miR-127-3p mimics

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，miR-127-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者腦脊液中表達水平低于健康人群，這為研究miR-127-3p與神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)系提供了臨床依據(jù)，并且miR-127-3p可能作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)志物。本研究結(jié)果與既往發(fā)表結(jié)果一致，研究者通過基因芯片及生物信息學(xué)方法研究顯示，miR-127-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)低表達[8]。本研究還通過比較人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U373、U87、SHG44和人腦正常膠質(zhì)細(xì)胞株HEB中miR-127-3p相對表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中miR-127-3p相對表達水平均低于人腦正常膠質(zhì)細(xì)胞株。此外，Jiang等[10]人研究顯示，miR-127-3p在惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中也呈現(xiàn)低表達，miR-127-3p通過激活TGF-β信號通路抑制惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖。因此， miR-127-3p可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮重要作用。

為深入闡述miR-127-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)作用，本研究采用瞬時轉(zhuǎn)染miR-127-3p模擬物上調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的miR-127-3p表達水平，結(jié)果提示上調(diào)miR-127-3p能抑制U251細(xì)胞增殖且呈劑量依賴性，上調(diào)miR-127-3p還能促進U251細(xì)胞凋亡。上調(diào)miR-127-3p能抑制凋亡相關(guān)基因bcl-2、Mcl-1蛋白表達水平以及促進bax的蛋白表達水平。Bcl-2(B-cell lymphoma-2)是B淋巴細(xì)胞瘤-2基因，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用[11]。Bcl-2家族成員具有高度的同源性以及具有BH1、BH2、BH3、BH4等相似的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域。Bcl-2家族成員在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中并非發(fā)揮同樣的作用，Bcl-2家族根據(jù)其不同功能可分為抗凋亡和促凋亡兩類，抗凋亡基因主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL和Bcl-W等，屬于腫瘤細(xì)胞死亡的負(fù)向調(diào)控因子，保護神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在化療藥物、放療等外界刺激時免受凋亡；促進凋亡相關(guān)基因主要有Bax、Bad、Bid等[12-13]。有研究表明，miR-3175在膠質(zhì)瘤中表達水平明顯升高，轉(zhuǎn)染miR-3175抑制物后膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力得到有效抑制，miR-3175表達下降可導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、細(xì)胞色素C、Caspase-3的異常表達[14]。此外，多種化療藥物、中藥活性成分均能通過調(diào)控Bcl-2、Mcl-1和bax基因蛋白表達水平而抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖及促進其凋亡[15-16]。因此，miR-127-3p能抑制神經(jīng)膠質(zhì)U251細(xì)胞的增殖，并促進U251細(xì)胞凋亡，其機制可能與調(diào)控凋亡相關(guān)Bcl-2家族基因有關(guān)。

miRNA主要通過與靶基因mRNA 3'UTR區(qū)域結(jié)合而調(diào)控靶基因表達，進而調(diào)控靶基因在轉(zhuǎn)錄后的水平，從而廣泛參與多種惡性腫瘤生物學(xué)功能的調(diào)控過程[3]。miRNA可能有多個靶基因，多個miRNA也可能調(diào)控同1個靶基因。為闡明miR-127-3p調(diào)控的靶基因，本研究采用在線靶基因預(yù)測軟件預(yù)測得到miR-127-3p的可能靶基因是MAPK4，并且通過雙熒光素酶報告試驗證實miR-127-3p mimic能與MAPK4 mRNA的3'UTR區(qū)域結(jié)合，這提示miR-127-3p能直接作用于靶基因MAPK4。Zhang等[17]人研究表明，miR-127能介導(dǎo)靶基因IL-6基因調(diào)控口腔天皰瘡的發(fā)生發(fā)展。然而，miR-127-3p與靶基因MAPK4結(jié)合后是否能發(fā)揮功能作用需要得到進一步探討。本研究采用模擬物上調(diào)U251細(xì)胞的miR-127-3p表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAPK4 的蛋白表達水平被抑制，這提示miR-127-3p可能通過直接結(jié)合MAPK4而抑制其表達水平。

MAPK4屬于絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，參與調(diào)控多種細(xì)胞的增殖和分化[18]。MAPK在多種惡性腫瘤中存在異?；罨瑥堨o等[19]人通過免疫組化分析顯示，MAPK及p-MAPK在人膠質(zhì)瘤組織中陽性表達區(qū)域面積百分率均高于正常腦組織，提示MAPK及其異常活化與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。此外，麥秀英等[20]人采用生物信息學(xué)分析表明，胰島素樣生長因子受體Ⅰ的3'UTR有多種miRNAs的結(jié)合位點，并參與信號通路中MAPK及PI3K/AKT的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控膠質(zhì)瘤的形成和發(fā)展。那么，結(jié)合本研究miR-127-3p靶向調(diào)控MAPK4的結(jié)果，本研究推測miR-127-3p通過下調(diào)靶基因MAPK4而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，但miR-127-3p介導(dǎo)靶基因MAPK4調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的作用仍有待進一步深入研究。

總之，本研究結(jié)果表明miR-127-3p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的腦脊液中呈低表達，上調(diào)miR-127-3p能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與調(diào)控Bcl凋亡相關(guān)基因及抑制靶基因MAPK4有關(guān)。