肖毓華 徐杰 李鋆
【摘要】 目的:探究在大鼠神經(jīng)旁路移植術后應用FK1706對促進神經(jīng)再生的作用。方法:SD雄性成年大鼠20只,隨機分成兩組,每組10只,行左坐骨神經(jīng)開窗離斷-自體橈神經(jīng)旁路移植術。實驗組(FK1706組)術后即日開始連續(xù)8周左下肢局部肌注FK1706(0.32 mg/kg),對照組做空白對照。8周后行左側坐骨神經(jīng)電生理監(jiān)測、左腓腸肌肌肉濕重及肌纖維橫截面積測定。結果:8周后,實驗組的CAMP波幅高于對照組,MNCV快于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗組的腓腸肌濕重及肌纖維面積均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組的近端有髓神經(jīng)纖維數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),實驗組遠端有髓神經(jīng)纖維數(shù)、纖維橫截面積均明顯優(yōu)于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論:大鼠神經(jīng)旁路移植術后應用FK1706能夠移植神經(jīng)再生。
【關鍵詞】 FK1706; 自體神經(jīng)移植; 神經(jīng)再生
Study on Effect of FK1706 to Accelerate Neuroregeneration after Nerve Bypass Grafting Surgery/XIAO Yuhua,XU Jie,LI Jun.//Medical Innovation of China,2018,15(13):023-026
【Abstract】 Objective:To investigate the effects of FK1706 to neuroregeneration after nerve bypass grafting.Method:20 adult male SD rats were randomly divided into two groups,10 cases in each group,the left sciatic nerve fenestration and autologous radial nerve bypass grafting was performed.In the experimental group,F(xiàn)K1706(0.32 mg/kg) was injected into the left lower extremities for 8 weeks immediately after the operation,the control group was made blank control.After 8 weeks,the electrophysiological monitoring of the left sciatic nerve,the wet weight of the left gastrocnemius muscle and the cross section of the muscle fiber were measured.Result:After 8 weeks,the amplitude of CAMP in the experimental group was higher than that in the control group,MNCV was faster than that of control group,the differences were statistically significant(P<0.01).The wet weight and fiber area of gastrocnemius in the experimental group were higher than those in the control group(P<0.05).There was no significant difference in the number of myelinated nerve fibers between the two groups(P>0.05),the number and cross-sectional area of distal myelinated nerve fibers in the experimental group were significantly better than those in the control group,the differences were statistically significant(P<0.01).Conclusion:The effects of FK1706 to accelerate neuroregeneration after nerve bypass grafting surgery is siginicant.
【Key words】 FK1706; Autogenous nerve transplantation; Neuroregeneration
First-authors address:Fujian Provincial Hospital,F(xiàn)uzhou 350001,China
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2018.13.006
神經(jīng)旁路移植術在臨床上可用于治療有神經(jīng)瘤生成的周圍神經(jīng)損傷,該手術方式既保留了神經(jīng)原有的功能,還增加了動力神經(jīng)[1]。實驗報道肯定了神經(jīng)旁路移植術后移植神經(jīng)再生的現(xiàn)象。臨床上周圍神經(jīng)再生速度1~2 mm/d,修復效果欠佳,因此,希望找到一種促進神經(jīng)再生且副作用小的藥物。
已被FDA認證的FK506是一種免疫抑制性藥物[2]。FK506在廣泛應用于器官移植后免疫抑制的領域中發(fā)現(xiàn)其具有促進神經(jīng)生長的作用[3],但FK506本身對人體組織器官具有強效免疫抑制作用,這大大局限了FK506在神經(jīng)損傷后治療作用。FK1706作為FK506的衍生物在2005年首先被報道[4],其保留了促神經(jīng)生長的作用,很大程度上弱化了FK506的免疫抑制作用。有文獻報道,F(xiàn)K1706能夠促進軸突再生的基因轉錄和表達[5]。本研究建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型,肌注FK1706藥物進行干預,以評價其促進神經(jīng)再生的作用。
1 材料與方法
1.1 試劑與器材 FK1706:南京大學實驗室合成;二甲基亞砜(DMSO):日本sigma-D2650;電子分析天平:Sartorius-BS224S,精度為0.1 mg;透射電子顯微鏡:PHILIPS EM208;光學顯微鏡:Olympus,日本;超薄切片機:Leica UC-6型;游標卡尺:上海量具廠;肌電/誘發(fā)電位儀:Keypoint,美國Medtronic公司;手術顯微鏡:SXP-1B型,上海醫(yī)用光學儀器廠;顯微手術器械:SFZ-967,上海手術器械分廠。藥液配置:電子分析天平準確稱量FK1706粉劑0.056 0 g,充分溶解于56 mL DMSO,移液管移入試劑瓶中,標記為FK1706溶液,存于4 ℃冰箱備用。
1.2 模型制備 腹腔麻醉[2.5%苯巴比妥鈉
(40 mg/kg)]大鼠后,體位取平臥位,有效固定,備皮消毒鋪巾,取8 mm左側橈神經(jīng)備用。大鼠體位轉變?yōu)楦┡P位,有效固定,在大鼠左大腿做一縱向切口,逐層進入分離組織,見坐骨神經(jīng)。持針鉗于顯微鏡下鉗夾其神經(jīng)干10 s,鏡下確認完全離斷神經(jīng)干,僅有外膜相連。于鉗夾點兩端3 mm處外膜上分別開一1.5 mm直徑的窗口,將自體橈神經(jīng)與兩側窗口行端側吻合,確定無活動性出血后逐層縫合。神經(jīng)旁路移植模型見圖1。
1.3 實驗動物分組與藥物干預 苦味酸標記雄性健康成年SD大鼠20只,200~250 g/只(由福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供)。隨機分為實驗組、對照組,每組10只。大鼠由專人飼養(yǎng),研究過程中對大鼠的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見的要求》[6]。實驗組大鼠左側大腿肌注0.32 mg/kg的FK1706試劑,連續(xù)8周(含術日),1次/d。對照組空白,正常喂養(yǎng)。
1.4 觀察指標 (1)坐骨神經(jīng)電生理監(jiān)測:8周后對大鼠左下肢進行電生理監(jiān)測。行腹腔麻醉[2.5%苯巴比妥鈉(40 mg/kg)]后,取平臥位,固定后術區(qū)消毒鋪巾,逐層進入,暴露坐骨神經(jīng),分離腓腸肌。記錄電極插入腓腸肌肌腹,接地電極連接大鼠尾部。于坐骨神經(jīng)端側吻合口近端坐骨結節(jié)水平(P點)和遠端神經(jīng)分支處(D點)放置平行電極(兩極間距固定為2 mm),進行重頻電刺激(電流10 mA),記錄復合運動動作電位(CMAP)及其波幅,測量電極間距,計算運動神經(jīng)傳導速度(MNCV)。MNCV=兩次電極間距/動作電位潛伏期差值。電生理監(jiān)測過程中用生理鹽水保持肌肉濕潤,在室溫28 ℃下進行。(2)腓腸肌濕重及肌纖維面積:完整分離大鼠左側腓腸肌,修潔去除表面結構,立即置于電子分析天平上,測量肌肉濕重。稱重后的腓腸肌用10%的福爾馬林固定,脫水、石蠟包埋,在標本的最大橫徑作5 ?m厚的切片,HE染色后制片。在40倍目鏡、0.70 ?m/象數(shù)下測定肌纖維橫截面積。(3)有髓神經(jīng)纖維數(shù)及截面積:分別于坐骨神經(jīng)兩端吻合口3 mm處取材(2~3 mm)。以10%的福爾馬林固定,制片0.5 ?m后HE染色。在400倍光鏡下,統(tǒng)計有髓神經(jīng)纖維數(shù)量。在40倍目鏡TJTY-300圖像分析儀、定標值為0.38 ?m/象數(shù)的條件下測量神經(jīng)纖維橫截面積。作1條過視野中心的直線,測定該直線上神經(jīng)纖維的橫截面積。
1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù),計量資料用(x±s)表示,組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 一般情況 麻醉意外死亡2只,及時進行了補充。實驗期間各組大鼠一般情況可。
2.2 兩組坐骨神經(jīng)電生理監(jiān)測結果對比 8周后,實驗組的CAMP波幅高于對照組,MNCV快于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1。
2.3 兩組腓腸肌濕重及肌纖維橫截面積對比 8周后,實驗組肌肉濕重(753.54±105.91)mg,重于對照組(598.02±65.02)mg,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.957,P<0.05)。實驗組腓腸肌肌纖維橫截面積(246.55±50.41)μm2,大于對照組的(178.90±33.59)μm2,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.532,P<0.05)。
2.4 兩組有髓神經(jīng)纖維數(shù)與橫截面積比較 兩組的近端有髓神經(jīng)纖維數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);試驗組遠端有髓神經(jīng)纖維數(shù)、神經(jīng)纖維橫截面積明顯大于對照組(P<0.01),見表2。
3 討論
周圍神經(jīng)完全或不完全損傷后,諸多因素影響其功能恢復,例如年齡、損傷類型、程度、平面、修復時機、手段及康復訓練等[7-8]。影響因素中最重要的是神經(jīng)損傷到行神經(jīng)修復的時間。由于神經(jīng)損傷,肌肉失去神經(jīng)支配,去神經(jīng)化超過一定的時間后,運動終板功能將不可逆破壞及導致不同程度的肌肉萎縮[8]。Sunderland等[9]報道肌肉去神經(jīng)化時間長短與神經(jīng)肌肉功能恢復程度相關。目前臨床上治療周圍神經(jīng)損傷普遍采用神經(jīng)修復、神經(jīng)移植和應用促神經(jīng)生長藥物等[10-11]。但由于神經(jīng)再生速度緩慢[8,12],如何加快神經(jīng)再生速度及修復其結構成為臨床研究的熱點。
目前治療周圍神經(jīng)損傷常用的方法是自體神經(jīng)端端吻合和端側吻合移植[13]。文獻[14-16]分別在治療面癱和實驗研究中驗證了神經(jīng)端側吻合具有一定應用前景。本實驗采用的移植方法略不同于普通的端側吻合,動力神經(jīng)取自游離的自體橈神經(jīng),損傷神經(jīng)與動力神經(jīng)兩端進行端側吻合。旁路神經(jīng)移植術后應用FK1706試劑,明顯改善了損傷的神經(jīng)的結構和再生修復。
FK1706是FK506的衍生物,F(xiàn)K506可以表現(xiàn)出長期的加速神經(jīng)生長、再生的作用[17],但具有強效免疫抑制作用。Price等[18]通過實驗改變FK506的效應區(qū),合成了FK1706,保留了FK506促進神經(jīng)再生作用的同時,極大的減弱了免疫抑制作用,使之具有良好的應用前景。文獻[19]報道,F(xiàn)K1706促進神經(jīng)生長可能是通過與FKBP-52結合并激活MAPK信號傳導通路,刺激神經(jīng)生長因子(NGF)介導的軸突生長來實現(xiàn)的。FK1706不僅呈現(xiàn)劑量依賴性的促進神經(jīng)再生作用,還具有良好的治療窗。Yamaji等[19]通過實驗發(fā)現(xiàn)對于脊髓受損的大鼠,延遲1周后進行FK1706干預,仍然能夠促進神經(jīng)再生。FK1706的治療時間窗迎合了臨床治療的需要。
本實驗觀察到8周后實驗組CMAP的波幅、MNCV傳導速度、腓腸肌濕重截面積、遠端有髓神經(jīng)纖維數(shù)均優(yōu)于對照組(P<0.05),這表明實驗組對改善神經(jīng)損傷程度明顯優(yōu)于對照組。
在實驗對象的選擇上,本研究考慮到性激素對神經(jīng)再生會產(chǎn)生影響,故全部采用了成年健康雄性SD大鼠,消除實驗干擾。Koeing對黃體酮和雌雄性大鼠的建模支持這觀點[20-22]。
在實驗模型的選擇上,大鼠坐骨神經(jīng)干較粗且走形于大腿中上1/3部分沒有分支,并且可容易進行顯微操作,因此周圍神經(jīng)損傷和修復的研究常選用此模型[23]。
在評價神經(jīng)損傷后恢復和再生的指標選擇上,電生理和組織學檢查最為常用。電生理監(jiān)測包含波幅和傳導速度等項目。電生理檢查能用于判斷神經(jīng)再生,評價其手術后療效及功能恢復情況。波幅體現(xiàn)出了神經(jīng)纖維的數(shù)目和同步興奮的程度。神經(jīng)纖維較成熟且同步興奮度較高,波形規(guī)則且波幅較大。神經(jīng)傳導速度反映了沖動的傳導能力,當受損神經(jīng)開始修復時,隨著軸突、髓鞘的形成,神經(jīng)傳導速度加快[24]。通過實驗發(fā)現(xiàn),實驗組CMAP的波幅更大,MNCV更快,提示FK1706能夠促進神經(jīng)再生。
對神經(jīng)肌肉進行組織學檢查可以直接觀察其的形態(tài)學特征。對肌肉進行HE染色制片,可以觀察基本結構、肌纖維及肌肉的萎縮程度,以此判斷去神經(jīng)化情況。透射電鏡下測量髓鞘的各項參數(shù),由此可反映出神經(jīng)再生的情況。實驗組神經(jīng)纖維數(shù)、神經(jīng)纖維橫截面積均大于對照組(P<0.05)。因此,筆者推論:FK1706較對照組對神經(jīng)再生有著改善作用。
本實驗研究證實了,F(xiàn)K1706對神經(jīng)旁路移植術后大鼠神經(jīng)CMAP、MNCV、腓腸肌濕重和截面積、有髓神經(jīng)纖維數(shù)、再生髓鞘厚度、再生軸突直徑比具有改善作用,F(xiàn)K1706具有促進神經(jīng)旁路移植術后再生神經(jīng)的作用[25-26]。
感謝福建省立醫(yī)院骨二科在撰寫論文方面的幫助,感謝福建省立醫(yī)院科研科全體老師的關懷,感謝福建醫(yī)科大學動物實驗中心在實驗方面給予的大力支持。
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(收稿日期:2018-01-24) (本文編輯:張爽)