血管內皮生長因子對急性心肌梗死大鼠保護作用的研究

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隨著超重、高血壓、高血脂、糖尿病等基礎性疾病發(fā)病率逐年升高，心血管疾病已成為威脅公眾健康的重要疾病[1 -2]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是最為常見的心血管系統(tǒng)疾病，年致死數(shù)約100萬[3]；其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的危急重癥，致死率高居疾病譜第2位[4]，并且AMI發(fā)病率還有逐漸上升的趨勢。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種促血管生長因子，能夠促進血管內皮細胞增殖并誘導血管生成[5 -6]，并且具有高度特異性。但VEGF對AMI是否具有保護作用及其作用機制尚未完全明確，本研究通過建立AMI大鼠模型并給予VEGF進行干預治療，分析VEGF對AMI大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用清潔級雄性SD大鼠(鼠齡8周齡，體質量250 g～300 g)購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2013 -1 -003。

1.2 實驗藥物與試劑 VEGF(美國Cytolab公司)；紅四氮唑(TTC，美國Sigma公司)；門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司；HE試劑盒、TUNEL試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 動物人工呼吸機(DW -2000型，上海恒勤儀器設備有限公司)；生物機能實驗系統(tǒng)(BL -420S型，成都泰盟科技有限公司)；石蠟切片機(RM -2135型，德國Leica公司)；全自動生化分析儀(BS -200型，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型的制備與分組 采用麻醉后分離并結扎冠狀動脈的方法建立急性心肌梗死大鼠模型，實驗過程中實施心電圖監(jiān)測，以左心室前壁呈灰白至發(fā)紺、心電圖ST段抬高或T波高聳為造模成功標志。取40只模型大鼠隨機分為模型組和VEGF治療組，并另取20只同齡大鼠為假手術組(行手術通路但不結扎冠狀動脈)，結扎30 min后分別從尾靜脈注射給藥，VEGF治療組注射1 mL VEGF溶液(2 μg/mL，含肝素50 U/mL)，假手術組和模型組分別從尾靜脈注射1 mL生理鹽水(含肝素50 U/mL)。

1.4.2 超聲檢測 各組隨機取10只大鼠，采用Vevo770高分辨率超聲影像系統(tǒng)于取材前行超聲檢測，檢測方法：于左側胸骨旁取左室乳頭肌水平短軸切面，測量舒張末期左室內徑(LVIDd)、收縮末期左室內徑(LVIDs)、短軸縮短率(FS)、射血分數(shù)(EF)、每搏輸出量(SV)，所有檢測指標均取連續(xù)3個心動周期的平均值。

1.4.3 心臟/體質量比及心肌組織梗死面積的測定 取超聲檢測后的各組10只大鼠，稱量體質量，麻醉后開胸取心臟組織并稱其重量，計算心臟/體質量比；心臟組織稱重完成后，置于-20 ℃冰箱冷凍20 min后進行切片(厚度約2 mm)，置于2%TTC溶液中(37 ℃恒溫箱、避光)孵育15 min，經(jīng)處理后梗死區(qū)呈灰白色而正常組織呈紅色，然后通過BI -2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)分析心肌組織梗死面積。

1.4.4 血清中心肌酶含量的測定 在上述開胸取心臟組織前，開腹經(jīng)腹主動脈取血并離心(1 500 r/min離心、10 min)取血清，通過生化分析儀測定血清中心肌酶AST、CPK、LDH含量。

1.4.5 心肌組織形態(tài)結構改變及心肌細胞凋亡狀況的觀察 取各組剩余的10只大鼠，取心臟組織并置于4%多聚甲醛溶液中72 h進行固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，經(jīng)常規(guī)HE染色后通過顯微鏡觀察心肌組織病理性形態(tài)結構改變。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化處理后，按照TUNEL說明進行操作，通過光學顯微鏡觀察各組大鼠心肌細胞凋亡狀況。計算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)：每張染色切片分別在相同部位選取不重疊的6個視野，分別計數(shù)每個視野中的細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，各組取平均值后計算AI。AI=(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

2 結 果

2.1 各組大鼠超聲檢測結果 與假手術組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs顯著升高，F(xiàn)S、EF、SV顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，VEGF治療組LVIDd和LVIDs降低，并提高FS、EF和SV，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

組別nLVIDd(mm)LVIDs(mm) FS(%) EF(%) SV(μL)假手術組106.70±0.283.85±0.2943.11±7.4573.05±9.42187.13±26.84模型組107.26±0.291)6.23±0.412)15.27±3.162)29.81±6.902)77.52±16.912)VEGF治療組106.73±0.283)5.14±0.333)28.62±5.834)45.26±8.534)118.64±20.374) 與假手術組比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較,3)P<0.05,4)P<0.01。

2.2 各組大鼠心臟/體質量比和心肌組織梗死面積比較 與假手術組比較，模型組大鼠心臟/體質量比和心肌組織梗死面積均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，VEGF治療組心臟/體質量比降低，心肌組織梗死面積縮小，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

2.3 各組大鼠血清中心肌酶含量比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清AST、CPK、LDH含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，VEGF治療組血清中AST、CPK、LDH含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

2.4 心肌組織病理性形態(tài)結構改變觀察結果(見圖1) 與假手術組比較，模型組大鼠呈現(xiàn)心肌纖維紊亂；心肌細胞數(shù)量減少，空泡變性，胞核固縮、深染等病理性形態(tài)結構改變。與模型組比較，VEGF治療組大鼠心肌組織病變明顯較輕。

2.5 各組大鼠心肌細胞凋亡狀況及AI計算結果 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織凋亡細胞數(shù)量明顯增多；與模型組比較，VEGF治療組心肌細胞凋亡數(shù)量明顯減少。詳見圖2。計算并統(tǒng)計分析AI結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織細胞AI顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，VEGF治療組心肌細胞AI降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表4。

組別n心臟/體質量比×10-3梗死面積%假手術組102.48±0.530.0±0.0模型組 104.50±0.911)47.1±8.31)VEGF治療組103.52±0.612)23.9±5.03) 與假手術組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05,3)P<0.01。

A為假手術組；B為模型組；C為VEGF治療組。

A為假手術組；B為模型組；C為VEGF治療組。

表4 各組大鼠心肌組織細胞AI比較(±s) %

3 討 論

隨著人們生活水平的提高以及飲食結構的改變，體重超重和“三高”等基礎疾病發(fā)病率逐漸升高，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病最重要的誘因，而AMI是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的危急重癥，致死率高居疾病譜第2位，有效預防和治療AMI成為目前臨床研究的重點。

VEGF是一種具有高度特異性的促血管生長因子，既往研究發(fā)現(xiàn)VEGF具有促進血管內皮細胞增殖并誘導血管生成的藥理學作用[5 -6]。本實驗通過制備AMI大鼠模型并給予VEGF治療進行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)VEGF干預治療能夠有效緩解AMI大鼠心臟組織水腫并降低心肌組織梗死面積、改善心肌組織病變、抑制細胞凋亡，提示VEGF對AMI大鼠具有保護作用。

心臟組織超聲影像檢測是最直接反映心功能的方法，而血清中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量則能夠反映心肌細胞損傷程度，間接反映心功能狀況。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)VEGF干預治療能夠有效降低AMI大鼠LVIDd和LVIDs，提高FS、EF、SV，降低血清中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量，提示VEGF具有改善AMI大鼠心功能的作用。

綜上所述，VEGF對AMI大鼠具有一定的保護作用，其作用機制可能與VEGF能夠有效改善心功能、減輕心臟水腫、改善組織病變并抑制細胞凋亡有關。