加味地黃飲子對(duì)衰老小鼠腎臟組織P21、P53蛋白及其mRNA表達(dá)的影響

高 山，莊 哲，劉 釗，蔡國鋒，謝 寧，唐偉懿，馬 嫡，付 宇

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001； 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

衰老是所有生物都會(huì)發(fā)生的隨時(shí)間出現(xiàn)的增齡性變化，從微觀的細(xì)胞改變到宏觀的器官衰老、功能下降，包括人體的全部生理病理變化[1]。老齡導(dǎo)致的生理改變與某些疾病的初期病理變化在時(shí)間上無明顯分界，老齡化導(dǎo)致的器官功能衰竭逐漸演變成臨床疾病。在中國，11%的65歲以上老年人存在慢性腎臟疾病，衰老腎臟對(duì)外界環(huán)境的刺激缺乏抵抗能力，易遭到破壞[2-3]。因而，研究腎臟衰老機(jī)制及探究衰老腎臟的保護(hù)方法具有重要的意義。

加味地黃飲子源自古方地黃飲子。課題組針對(duì)疾病譜系和現(xiàn)代人的體質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行加減化裁，在臨床應(yīng)用和前期研究中發(fā)現(xiàn)其具有良好的延緩衰老作用。目前，對(duì)中醫(yī)藥延緩衰老的深層機(jī)制的研究較少[4-5]。本研究從衰老基因表達(dá)的角度，探討加味地黃飲子延緩腎臟衰老的作用機(jī)制，為其廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)ICR雄性小鼠40只，2月齡10只，體質(zhì)量20～25 g，18月齡30只，體質(zhì)量35～40 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(黑)2012-001]提供。飼養(yǎng)條件：20～25 ℃，自然照明，自由飲水和進(jìn)食。

1.2 藥物、試劑與儀器 加味地黃飲子水煎液(生藥濃度為0.26 g/mL)：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局；水溶性維生素E(批號(hào) 1420006707)：北京博奧拓科技有限公司；P21單克隆抗體(批號(hào) 028359)：美國Santa Crcz公司；P53單克隆抗體(批號(hào) 029457)：美國Thermo公司；β-actin鼠單克隆抗體(批號(hào) 040521)：武漢博士德公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào) 1601259)：上海默聯(lián)生物科技有限公司。

7050型全自動(dòng)生化分析儀：日本日立公司；超聲碎裂儀：美國Sonic公司；EnVision?多功能酶標(biāo)儀：上海珀金埃爾默有限公司；DNA電泳儀：美國BR公司；Image Plus version 5.0圖像分析系統(tǒng)：美國Gybernetics公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 將2月齡小鼠10只設(shè)為青年組。18月齡小鼠被隨機(jī)分為老年組、維生素E組、加味地黃飲子組，每組10只。青年組和老年組按每日10 mL/kg劑量灌胃生理鹽水，維生素E組按每日250 mg/kg劑量灌胃維生素E水溶液，加味地黃飲子組按每日2.6 g/kg劑量灌胃加味地黃飲子水煎劑。以上各組連續(xù)灌胃60 d。

2.2 標(biāo)本采集與處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉小鼠，腹主動(dòng)脈取血，收集血液標(biāo)本。處死小鼠，收集腎臟標(biāo)本并稱質(zhì)量，一部分石蠟包埋處理，另一部分液氮冷凍后在-80 ℃冰箱中保存。

2.3 一般狀況觀察和腎臟指數(shù)檢測(cè) 觀察實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠毛色、運(yùn)動(dòng)、反應(yīng)、體質(zhì)量等一般狀況。計(jì)算各組小鼠平均腎臟指數(shù)。計(jì)算公式：腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。

2.4 血清肌酐(serum creatinine, SCr)、尿素氮(blood urine nitrogen, BUN)檢測(cè) 采用日立7050生化分析儀檢測(cè)各組小鼠SCr、BUN水平。

2.5 腎臟組織病理學(xué)觀察 制備腎臟組織石蠟切片(厚度2～3 μm)，常規(guī)脫蠟，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)染色，觀察腎小球、腎小管、基質(zhì)等病理改變。

2.6 腎臟組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)水平檢測(cè) 將腎臟組織勻漿，離心后收集上清液，以酶學(xué)方法檢測(cè)SOD、GSH-Px水平，以硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA水平。

2.7 RT-PCR法測(cè)定P21、P53 mRNA的表達(dá) 引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。按RT-PCR試劑盒提供方法操作，以Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，上下游引物各2.5 μL，總反應(yīng)容積為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 min，60 ℃退火1 min，70 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

2.8 Western blot法測(cè)定P21、P53蛋白的表達(dá) 采用BCA法檢測(cè)腎臟組織蛋白濃度。每孔上樣50 μg蛋白樣本，SDS-PAGE電泳、分離、轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)膜封閉，經(jīng)過一抗、二抗孵育處理，洗膜后曝光。以同一膜上GAPDH作為內(nèi)參,在凝膠成像處理系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行圖像分析。

表1 RT-PCR引物序列

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠一般狀況及腎臟指數(shù)變化 實(shí)驗(yàn)前，青年組小鼠毛色潔白，運(yùn)動(dòng)活躍，反應(yīng)迅速；老年組與維生素E組和加味地黃飲子組小鼠毛色白，運(yùn)動(dòng)平穩(wěn)，反應(yīng)靈敏。60 d后，青年組小鼠毛色、運(yùn)動(dòng)、反應(yīng)無明顯變化，體質(zhì)量增加明顯；老年組小鼠毛色淡黃，運(yùn)動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量略增加；維生素E組與加味地黃飲子組小鼠毛色淡黃，運(yùn)動(dòng)平穩(wěn)，反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量略增加，且加味地黃飲子組小鼠運(yùn)動(dòng)、反應(yīng)表現(xiàn)優(yōu)于維生素E組。

與青年組比較，老年組小鼠腎臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與老年組比較，維生素E組腎臟指數(shù)無明顯差異，加味地黃飲子組腎臟指數(shù)明顯降低(P<0.05)。與維生素E組比較，加味地黃飲子組腎臟指數(shù)明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較

注：與青年組比較，*P<0.05；與老年組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05

3.2 各組小鼠SCr、BUN水平比較 與青年組比較，老年組SCr、BUN水平顯著上升(P<0.05)；與老年組比較，維生素E組小鼠SCr、BUN水平無明顯變化，加味地黃飲子組小鼠SCr、BUN水平顯著降低(P<0.05)；與維生素E組比較，加味地黃飲子組小鼠SCr、BUN水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

3.3 各組小鼠腎臟病理學(xué)變化 青年組小鼠無腎小球硬化、腎小管萎縮、系膜基質(zhì)增生、炎性細(xì)胞浸潤表現(xiàn)。老年組小鼠出現(xiàn)腎小球硬化、腎小管萎縮、系膜基質(zhì)增生、炎性細(xì)胞浸潤。與老年組比較，維生素E組和加味地黃飲子組硬化腎小球數(shù)目減少，腎小管萎縮、系膜基質(zhì)增生、炎性細(xì)胞浸潤減輕，加味地黃飲子組病理變化的改善情況優(yōu)于維生素E組。見圖1。

表3 各組小鼠SCr、BUN水平比較

注：與青年組比較，*P<0.05；與老年組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05

注：A.青年組；B.老年組；C.維生素E組；D.加味地黃飲子組

圖1各組小鼠腎臟組織病理學(xué)變化比較(HE染色，10×20倍)

3.4 各組小鼠腎組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較 與青年組比較，老年組小鼠腎組織SOD、GSH-Px水平顯著下降，MDA水平顯著上升(P<0.05)。與老年組比較，維生素E組小鼠腎組織SOD水平明顯上升(P<0.05)，GSH-Px、MDA水平無明顯變化(P>0.05)；加味地黃飲子組SOD、GSH-Px水平顯著上升，MDA水平明顯降低(P<0.05)。與維生素E組比較，加味地黃飲子組SOD、GSH-Px水平顯著上升，MDA水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腎組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較

注：與青年組比較，*P<0.05；與老年組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05

3.5 各組小鼠腎組織P21、P53及其mRNA表達(dá)水平比較 與青年組比較，老年組小鼠腎組織P21、P53及其mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與老年組比較，維生素E組和加味地黃飲子組小鼠腎組織P21及P21 mRNA、P53 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。加味地黃飲子組P21、P53及其mRNA表達(dá)水平明顯低于維生素E組(P<0.05)。見表5和圖2。

表5 各組小鼠腎組織P21、P53及其mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

注：與青年組比較，*P<0.05；與老年組比較，#P<0.05；與維生素E組比較，△P<0.05

注：A.青年組；B.老年組；C.維生素E組；D.加味地黃飲子組

圖2各組小鼠腎組織P21、P53蛋白表達(dá)水平比較(Western blot法)

4 討論

WTO將亞太地區(qū)60歲以上者劃分為老年人。隨年齡增長(zhǎng)，人體各器官都會(huì)逐漸衰老，腎臟是較早衰老的器官之一。衰老后的腎臟解剖結(jié)構(gòu)、生理代謝方面發(fā)生退行性變化，導(dǎo)致腎臟發(fā)生老年性功能改變[6]。但通常狀態(tài)下，老年腎臟仍能維持穩(wěn)態(tài)，可是一旦出現(xiàn)某些疾病使腎臟負(fù)荷加重，使內(nèi)環(huán)境不穩(wěn)定，老年人的腎臟功能就會(huì)出現(xiàn)異常，甚至衰竭。近年來中國才開始研究腎臟衰老，其意義受到日益廣泛的關(guān)注。

地黃飲子原方出自《黃帝素問宣明論方》，由熟地黃、山茱萸、石菖蒲、巴戟天、五味子、石斛、遠(yuǎn)志等組成。本方具有滋補(bǔ)腎陰腎陽、化痰開竅的功效，主治下元虛衰、陰陽兩虛、痰濁上犯之證。熟地黃滋陰養(yǎng)血、益髓補(bǔ)精，主補(bǔ)血?dú)?、滋腎水、益真陰。山茱萸平補(bǔ)陰陽，壯元?dú)?，秘精。巴戟天為補(bǔ)腎要?jiǎng)蓮?qiáng)陽益精。本課題組結(jié)合現(xiàn)代人體質(zhì)特點(diǎn)化裁原方，去掉附子等過于溫?zé)岬乃幬?。研究發(fā)現(xiàn)，地黃飲子可以升高膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)的表達(dá)，減輕膽堿能系統(tǒng)的損害[7-8]。宮健偉等研究發(fā)現(xiàn)，地黃飲子具有明顯升高大鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px和抑制MDA的作用，減少自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，具有良好的抗氧化損傷作用[9]。程小麗等[10]研究發(fā)現(xiàn)，加味地黃飲子具有上調(diào)熱休克蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子的作用。劉瑩等[11]研究表明，地黃飲子可以調(diào)控蛋白激酶B、果蠅雷帕霉素靶蛋白的表達(dá)而干預(yù)果蠅細(xì)胞的凋亡。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，地黃飲子加減方具有抗海馬組織衰老的作用[12]。本實(shí)驗(yàn)是在前期研究基礎(chǔ)上的延伸性研究。地黃飲子加減方可調(diào)節(jié)腦組織SOD、MDA、GSH-Px含量，表現(xiàn)出較明顯的抗氧化作用，其作用機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，故以維生素E組作為對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自然衰老的老年組小鼠出現(xiàn)明顯的衰老性外觀變化，腎臟指數(shù)上升，腎功能及反映機(jī)體衰老的SOD、GSH-Px、MDA酶學(xué)指標(biāo)發(fā)生改變，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)小鼠腎小球硬化數(shù)量增多，腎小管萎縮，間質(zhì)大量增生，說明這一模型充分模擬了衰老的人體內(nèi)環(huán)境。加味地黃飲子組小鼠的外觀性變化，腎臟指數(shù)，腎功能以及酶學(xué)指標(biāo)SOD、GSH-Px、MDA的改善顯著優(yōu)于老年組和維生素E組，腎小球硬化數(shù)量減少，腎小管萎縮、腎間質(zhì)增生減輕，說明加味地黃飲子可以對(duì)小鼠腎臟組織的衰老產(chǎn)生干預(yù)作用。

與生化指標(biāo)、病理學(xué)改變相對(duì)應(yīng)，衰老標(biāo)志物P21、P53及其mRNA表達(dá)在加味地黃飲子組明顯下降，說明其可能通過干預(yù)細(xì)胞調(diào)控因子，影響細(xì)胞增殖周期，而發(fā)揮抗衰老作用。P21、P53是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，其蛋白表達(dá)與衰老直接相關(guān)[13]。當(dāng)細(xì)胞受到某種外界刺激時(shí)，P53蛋白應(yīng)激性快速上調(diào)，進(jìn)一步激活P21蛋白，使P21蛋白磷酸化受到抑制，正常細(xì)胞周期受阻，產(chǎn)生細(xì)胞衰老[14-15]。本研究結(jié)果表明，加味地黃飲子干預(yù)后小鼠P21、P53 mRNA表達(dá)水平明顯降低，推測(cè)加味地黃飲子可能通過下調(diào)P21、P53基因表達(dá)來延緩衰老。

綜上，本研究表明，加味地黃飲子可以干預(yù)小鼠衰老腎臟組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)P21、P53蛋白及其mRNA表達(dá)，可初步揭示其抗衰老的作用機(jī)制。