鹽酸文拉法辛對(duì)抑郁癥小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸活性及腦組織中神經(jīng)元數(shù)量的影響

肖 音，肖 斌，趙 娜，陳曉亮

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院藥學(xué)部，海南 海口 570208；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)鄂爾多斯臨床醫(yī)學(xué)院臨床藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

抑郁癥病因復(fù)雜，目前尚不完全清楚，主要涉及遺傳、生物學(xué)、免疫、社會(huì)環(huán)境、心理和文化等多個(gè)方面。抑郁癥是一種以情緒低落、悲觀厭世、認(rèn)知和睡眠障礙為主要特征的情感性精神障礙[1-2]。據(jù)報(bào)道，目前世界上約有3.5億抑郁患者，抑郁癥已成為世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)疾病之一[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2020年抑郁癥將成為人類死亡的第2大疾病[4]。目前，市面上治療抑郁的藥物只能延緩其發(fā)病時(shí)間，而不能根治疾病[5]?？挂钟羲幬镏饕ㄟx擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)再攝取抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑、非典型抗抑郁藥及其他抗抑郁藥等。鹽酸文拉法辛能有效拮抗5-HT和去甲腎上腺素的再攝取，對(duì)多巴胺再攝取也有一定的拮抗作用，主要用于治療抑郁癥[6]。本研究旨在探討鹽酸文拉法辛治療抑郁癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組無(wú)特定病原體級(jí)雄性昆明種小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXY(遼)2013-2016號(hào)。50只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、氟西汀組、鹽酸文拉法辛低劑量組和鹽酸文拉法辛高劑量組，每組10只。

1.2藥品、試劑與儀器鹽酸文拉法辛購(gòu)自蘇州惠氏制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20160078；氟西汀購(gòu)自蘇州禮來(lái)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20170022；硝酸銀、5-HT、皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)、干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)及促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自大連美侖生物有限公司；ZW-H500電子顯微鏡購(gòu)自廣東深圳市合興利儀器設(shè)備有限公司，H1850R冷凍離心機(jī)、MX-M酶標(biāo)儀購(gòu)自湖北湘儀塞得儀器有限公司。

1.3抑郁癥小鼠模型制備正常對(duì)照組小鼠不制備抑郁癥模型，模型組、氟西汀組、鹽酸文拉法辛低劑量組和鹽酸文拉法辛高劑量組小鼠采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)方法制備抑郁癥模型[6]，具體方法：動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，第8～14天按照冷水(4 ℃)浸泡4 min、高溫環(huán)境(40 ℃)6 min、晝夜顛倒、強(qiáng)迫游泳6 min、夾尾30 min、禁水24 h、禁食16 h的順序進(jìn)行刺激，每日進(jìn)行1種刺激，7 d為1個(gè)周期，共刺激3個(gè)周期，連續(xù)刺激21 d。

1.4藥物干預(yù)在造模成功后，氟西汀組小鼠給予氟西汀2.5 mg·kg-1·d-1灌胃，鹽酸文拉法辛低劑量組小鼠給予鹽酸文拉法辛1.5 mg·kg-1·d-1灌胃，鹽酸文拉法辛高劑量組小鼠給予鹽酸文拉法辛3.0 mg·kg-1·d-1灌胃，模型組小鼠給予等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥15 d。正常對(duì)照組小鼠不給予任何干預(yù)。

1.5血清5-HT、CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平檢測(cè)末次給藥后第2天，摘除小鼠眼球取血，4 ℃ 下5 000 r·min-1離心10 min，取血清，置 于-80 ℃冰箱保存，待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清5-HT、CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6小鼠海馬和黑質(zhì)組織中神經(jīng)元數(shù)量檢測(cè)小鼠眼球取血后脫頸處死，取全腦，分離海馬和黑質(zhì)組織，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色，觀察并計(jì)數(shù)海馬和黑質(zhì)組織中染色的神經(jīng)元。顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)，采用Image J細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取均數(shù)。

2 結(jié)果

2.15組小鼠血清5-HT、CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平比較結(jié)果見(jiàn)表1。模型組小鼠血清5-HT水平顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；氟西汀組和鹽酸文拉法辛高劑量組小鼠血清5-HT水平顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；鹽酸文拉法辛低劑量組與模型組小鼠血清5-HT水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組小鼠血清CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平顯著高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；氟西汀組和鹽酸文拉法辛高劑量組小鼠血清CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；鹽酸文拉法辛低劑量組與模型組小鼠血清CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 5組小鼠血清5-HT、CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平比較Tab.1 Comparison of the levels of serum 5-HT，CORT，IFN-γ，CRH and ACTH of mice in the five groups

2.25組小鼠黑質(zhì)和海馬組織中神經(jīng)元數(shù)量比較結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2和表2。模型組小鼠海馬和黑質(zhì)組織中神經(jīng)元數(shù)量顯著少于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氟西汀組和鹽酸文拉法辛高劑量組小鼠海馬和黑質(zhì)組織中神經(jīng)元數(shù)量顯著多于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；鹽酸文拉法辛低劑量組與模型組小鼠海馬和黑質(zhì)組織中神經(jīng)元數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：氟西汀組；D：鹽酸文拉法辛低劑量組；E：鹽酸文拉法辛高劑量組。

A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：氟西汀組；D：鹽酸文拉法辛低劑量組；E：鹽酸文拉法辛高劑量組。

表2 5組小鼠黑質(zhì)和海馬組織中神經(jīng)元數(shù)量比較Tab.2 Comparison of the number of neurons in substantia nigra and hippocampus tissues of mice in the five groups

3 討論

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，目前，關(guān)于抑郁癥發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)主要有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)、神經(jīng)元可塑性假說(shuō)、應(yīng)激與下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸調(diào)節(jié)假說(shuō)和細(xì)胞因子假說(shuō)等[7-9]，其中，經(jīng)典的單胺類遞質(zhì)假說(shuō)仍然在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)主導(dǎo)地位，即抗抑郁藥物能通過(guò)提高腦組織內(nèi)單胺類遞質(zhì)水平而發(fā)揮抗抑郁作用[10]。目前發(fā)現(xiàn)的單胺類的神經(jīng)遞質(zhì)主要包括5-HT、多巴胺、去甲腎上腺素等。臨床上部分抗抑郁藥物是基于以上假說(shuō)來(lái)治療抑郁癥，如三環(huán)類抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑等[11-13]。鹽酸文拉法辛是一種臨床常用的5-HT抑制劑類抗抑郁藥。

應(yīng)激假說(shuō)認(rèn)為，長(zhǎng)期慢性刺激是惡劣心境障礙等抑郁發(fā)作的明顯促發(fā)因素[14]。采用CUMS方法建立的動(dòng)物模型能成功模擬人類抑郁癥心境低落、快感缺乏的癥狀，被認(rèn)為是與抑郁癥患者臨床表現(xiàn)最為接近的動(dòng)物模型[15]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的慢性刺激會(huì)導(dǎo)致HPA軸持續(xù)亢進(jìn)，引起IFN-γ、CORT和CRH水平異常升高，導(dǎo)致海馬組織損傷，由于HPA軸的雙向調(diào)節(jié)作用，IFN-γ、CORT和CRH水平異常升高反過(guò)來(lái)會(huì)減弱對(duì)HPA軸和糖皮質(zhì)激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，HPA軸紊亂和持續(xù)激活及其帶來(lái)的大腦損傷是抑郁癥的重要病理學(xué)特征之一[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)5-HT系統(tǒng)對(duì)ACTH分泌有抑制作用，當(dāng)患者腦內(nèi)5-HT功能低下時(shí)，垂體ACTH分泌增加，致使外周皮質(zhì)醇分泌增加，地塞米松抑制試驗(yàn)脫抑制；由于ACTH主要受HPA軸調(diào)節(jié)，故5-HT對(duì)HPA軸會(huì)產(chǎn)生影響；此外，5-HT能神經(jīng)元纖維可投射到下丘腦和邊緣系統(tǒng)區(qū)域，對(duì)CRH神經(jīng)元密集的大腦區(qū)域也有支配作用，還可以間接提高CORT水平，影響HPA軸的活性[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清5-HT水平顯著低于正常對(duì)照組，氟西汀組和鹽酸文拉法辛高劑量組小鼠血清5-HT水平顯著高于模型組，鹽酸文拉法辛低劑量組與模型組小鼠血清5-HT水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組小鼠血清CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平顯著高于正常對(duì)照組，氟西汀組和鹽酸文拉法辛高劑量組小鼠血清CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平顯著低于模型組，鹽酸文拉法辛低劑量組與模型組小鼠血清CORT、IFN-γ、CRH及ACTH水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明鹽酸文拉法辛不僅可以提高抑郁癥小鼠血清5-HT的水平，還能調(diào)節(jié)HPA軸活性。因此，作者推測(cè)，鹽酸文拉法辛的抗抑郁作用可能與提高5-HT水平及調(diào)節(jié)HPA軸活性有關(guān)。

黑質(zhì)和海馬在調(diào)節(jié)情緒和情感方面起重要作用，其功能缺損被認(rèn)為是精神異常及神經(jīng)退行性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。抑郁癥患者黑質(zhì)、海馬區(qū)域的神經(jīng)元活性均低于健康人，且此3個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)量有減少的趨勢(shì)，尤其是海馬組織的神經(jīng)元數(shù)量減少最為顯著。海馬不僅與學(xué)習(xí)、記憶、情感等高級(jí)認(rèn)知功能有密切關(guān)系，還是抑郁障礙多重發(fā)病因素的共同交匯點(diǎn)，也是接受新信息的重要結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬和黑質(zhì)組織中神經(jīng)元數(shù)量顯著少于正常對(duì)照組，氟西汀組和鹽酸文拉法辛高劑量組小鼠海馬和黑質(zhì)組織中神經(jīng)元數(shù)量顯著多于模型組，鹽酸文拉法辛低劑量組與模型組小鼠海馬和黑質(zhì)組織中神經(jīng)元數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這表明鹽酸文拉法辛可能會(huì)通過(guò)增加海馬和黑質(zhì)組織中神經(jīng)元數(shù)量而發(fā)揮抗抑郁作用。因此，作者推測(cè)，鹽酸文拉法辛的抗抑郁作用與增加黑質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量有關(guān)。

綜上所述，鹽酸文拉法辛的抗抑郁作用機(jī)制可能與提高5-HT水平、調(diào)節(jié)HPA軸活性及增加黑質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量有關(guān)。