富民枳種質(zhì)資源的SSR遺傳多樣性研究*

張珊珊,甘云浩,楊文忠,段宗亮,丁紅茜,康紅梅,諾蘇那瑪

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南 昆明650201;2.國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點實驗室,云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室,云南 昆明650201;3.昆明市瀕危動植物收容拯救中心,云南 昆明650224;4.賓夕法尼亞州立大學(xué)理學(xué)院,賓夕法尼亞斯泰特科利奇16563)

物種保護(hù)的最終目標(biāo)是保存足夠的遺傳多樣性[1-3],從而保持其適應(yīng)生境變化的潛力。遺傳多樣性研究不僅能反映出瀕危植物多樣性的高低,還能為制定有針對性的保育策略提供科學(xué)依據(jù)[4-6]。有學(xué)者研究表明,很多瀕危植物種群的遺傳多樣性水平低,可能是導(dǎo)致其瀕危的主要原因,并在研究基礎(chǔ)上提出了相應(yīng)的保護(hù)措施。但是,究竟何種保護(hù)措施是有效的,目前并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。研究指出,珍稀瀕危植物保護(hù)的終極目標(biāo)在100年內(nèi)保持其90%以上的遺傳多樣性才能稱之為 “成功保護(hù)”[7-8]。因此,在采取保育措施時,如何根據(jù)目的物種遺傳多樣水平的高低,確定種群的有效樣本量大小,才能既不會造成人力等各種資源的浪費,又達(dá)到 “成功保護(hù)”的目標(biāo),需要進(jìn)一步研究[9-13]。

富民枳 (Poncirus polyandra)屬典型的極小種群野生植物,其天然種群已經(jīng)滅絕[14]。目前,對富民枳采取了一些保護(hù)措施,共建立9個種質(zhì)資源收集圃和1個野外回歸種群。然而,富民枳種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平如何,采取的保護(hù)措施在遺傳水平上是否有效,都不得而知。

利用分子標(biāo)記研究種質(zhì)資源的遺傳多樣性,可為其遺傳管理提供理論依據(jù)[15-16]。SSR遺傳標(biāo)記因其具有重復(fù)性、穩(wěn)定性高的優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性研究[17-18]。因此,本研究采用SSR分子標(biāo)記對富民枳進(jìn)行遺傳分析,旨在獲得準(zhǔn)確可靠的遺傳多樣性信息,進(jìn)而評價種質(zhì)保存和種群恢復(fù)是否達(dá)到 “成功保護(hù)”的目標(biāo),為開展基于遺傳多樣性結(jié)果的其他有效遺傳管理策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從富民枳的9個種質(zhì)資源收集地和1個人工回歸地,共采集170份新鮮葉片樣品 (表1)。在詳細(xì)記錄植株編號的同時,于2016年春季采集健康幼嫩的葉片,用硅膠快速干燥并拍照,帶回實驗室,用75%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的無水乙醇擦拭清洗,最后用液氮冷凍貯存以備提取DNA。

表1 供試材料Tab.1 Plant materials for this study

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

采用改良CTAB法提取基因組DNA[19]。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量,紫外分光光度計檢測DNA濃度,合格樣品置于-20℃保存?zhèn)溆?。吸?L DNA和6L 1×溴酚藍(lán)混合進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,300V電壓下跑12min。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序

基于張珊珊等[19]篩選出的5對具片段多態(tài)性的引物,對170個樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用15L體系如下:2×Taq Master Mix 7.5L,正向引物1L(10mmol/L),反向引物1L(10mmol/L),模板DNA1L,滅菌ddH2O 4.5L。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,63℃退火30s,72℃延伸20s,30個循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 (2L樣品+6μL溴酚藍(lán)),300V電壓下12min,獲取鑒定膠圖。

1.2.3 毛細(xì)管電泳

通過膠圖確定模板濃度,加水稀釋到電泳所需濃度。上機(jī)進(jìn)行毛細(xì)管電泳:(1)將HiDi與500bp的內(nèi)標(biāo)按130∶1混合,配成mix;(2)用國產(chǎn)96孔反應(yīng)板分裝mix,每個孔中加入10μLmix;(3)對應(yīng)著在96孔板中加入0.5μL樣品模板,離心到4 000rpm即停;(4)用金屬浴加熱器將混合板95℃加熱預(yù)變性5min,拿出后立即放入-20℃冰箱;(5)冷卻后拿出,4 000rpm離心30s,解凍、混勻;(6)上3730測序儀進(jìn)行毛線管電泳;(7)獲取下機(jī)結(jié)果并分析,篩選出多態(tài)性較好的位點。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用POPGENE Version 1.32軟件計算有效等位基因數(shù) (Ne)、平均期望雜合度 (He)、觀測雜合度 (Ho)和Shannon信息指數(shù) (I);利用PIC_Calc 0.6軟件計算各引物的多態(tài)性信息含量(PIC)值;利用Gene mapper 4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)準(zhǔn)確位點的分析后,通過Populations 1.2.30軟件構(gòu)建鄰接 (Neighbour-joining)樹;利用FigTree v1.4.0軟件繪制聚類圖;利用Origin 7.0軟件對富民枳遺傳多樣性水平變化趨勢進(jìn)行擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

從圖1看出,毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。富民枳的遺傳多樣性較低:平均PIC值為0.337 8,平均 Nei's遺傳多樣性指數(shù)為0.430 0,平均Shannon信息指數(shù) (I)為0.642 8(表2)。不同引物組合的有效等位基因數(shù)平均為1.798 7;其平均期望雜合度 (He)為0.430 0,平均觀測雜合度(Ho) 為0.568 7。

圖1 富民枳部分樣品在Ciclev10001597m引物處擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳檢測Fig.1 Capillary electropherogram obtained by Ciclev10001597m primer of some samples from Poncirus polyandra

表2 基于5對SSR引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物在170份富民枳種質(zhì)資源中的遺傳多態(tài)性Tab.2 Genetic diversity estimated based on the amplified products by 5 SSR primers among 170 germplasms resources of Poncirus polyandra

2.2 聚類分析

利用鄰接法 (Neighbor-joining)對富民枳樣本進(jìn)行聚類分析 (圖2)。由圖2可知,170個富民枳樣本共聚類了65個分支末梢,屬于同一個分支末梢的富民枳被默認(rèn)為同等的遺傳關(guān)系。在每個末梢抽取一個樣本的基礎(chǔ)上,重新計算5對不同引物的擴(kuò)增片段在抽取的這65個有效樣本資源中的多態(tài)性 (表3),并繪制相應(yīng)的聚類圖 (圖3)。

圖2 基于鄰接法繪制的170個富民枳樣本聚類圖Fig.2 Dendrogram of 170 Poncirus polyandra samples based on neighbor-joining clustering method

表3 基于5對SSR引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物在65份富民枳種質(zhì)中的遺傳多態(tài)性Tab.3 Genetic diversity estimated based on the amplified products by 5 SSR primers among 65 germplasms of Poncirus polyandra

圖3 基于鄰接法繪制的65個富民枳樣本聚類圖Fig.3 Dendrogram of 65 Poncirus polyandra samples based on neighbor-joining clustering method

由表3可知65個有效富民枳樣本資源的多態(tài)性:多態(tài)性信息含量 (PIC)均在0.25-0.5之間,PIC范圍是0.302 6-0.429 5,平均0.353 6;Shannon信息指數(shù) (I)平均為0.681 6,范圍是0.562 3-0.865 8。平均期望雜合度 (He)為0.442 3,范圍是0.346 8-0.541 0;平均觀測雜合度 (Ho)為0.431 9,范圍是0.323 1-0.515 6。由圖3可知,富民枳的65個有效樣本資源共分為5個亞類 (Ⅰ類-Ⅴ類),其中Ⅰ類包括來自C1、C2、C3、C4、C7、C9和C10共7個地方的21個樣本資源,Ⅱ類包括來自C2、C3、C7和C8共4個地方的34個樣本資源,Ⅲ類包括來自C1、C2、C3、C7和C9共5個地方的6個樣本資源,Ⅳ類包括來自C2和C7兩個地方的2個樣本資源,Ⅴ類也包括來自C2和C7兩個地方的2個樣本資源。

2.3 評價不同種質(zhì)資源收集地的遺傳多樣性

富民枳10個種源地170份樣本的遺傳多樣性計算結(jié)果見表4。由表4可知,10個來源地的遺傳多樣性各不相同,其中,C1、C5、C6、C8和C10計5個地方的Shannon信息指數(shù)在0.502 9-0.567 4之間;C2、C3、C4、C7和C9共5個地方Shannon信息指數(shù)在0.609 8-0.640 8之間。基于前文 “關(guān)于屬于同一分支末梢的部分富民枳樣品遺傳關(guān)系可能相同”的結(jié)論,將聚類分析中系統(tǒng)發(fā)育樹每個末梢的所有樣本按所屬地進(jìn)行分組,即同一末梢 (基因型相同)來自相同地方的樣本只取1個分配到相應(yīng)的地方,也就保證每個地方保存的樣本均是來自不同末梢,使每個地方的樣本之間不存在重復(fù)。

表4 富民枳在不同樣本來源地的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity of Poncirus polyandra in different origins of samples

3 討論

3.1 富民枳的遺傳多樣性

物種遺傳多樣性保護(hù)是生物多樣性保護(hù)的重要部分[20],遺傳多樣性研究對于了解瀕危物種在未來環(huán)境下的適應(yīng)或進(jìn)化以及物種保護(hù)具有重要意義。對于極小種群野生植物,開展其遺傳多樣性研究可為制定能保持物種遺傳多樣性和進(jìn)化潛力的綜合保育措施提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)[21-25]。據(jù)報道,部分極小種群野生植物,例如巧家五針?biāo)?(Pinus squamata)[26]、云南藍(lán)果樹 (Nyssa yunnanensis)[27]、水松 (Glyptostrobus pensilis))[28]和版納青梅 (Vatica xishuangbannaensis)[29]等的遺傳多樣性都偏低,遺傳分化水平較高。本研究顯示,170份富民枳種質(zhì)資源的遺傳多樣性 (I=0.642 8)要低于65份富民枳種質(zhì)資源的的遺傳多樣性 (I=0.681 6),其原因可能是聚類圖2中同一個分支末梢的種質(zhì)材料遺傳關(guān)系相同。多態(tài)性信息含量(PIC)均值為0.337 8,Nei's遺傳多樣性指數(shù)(Nei)和有效等位基因數(shù) (Ne)都偏低,雜合度觀測值與雜合度期望值也相差甚遠(yuǎn),表明群體遺傳多樣性很低[30]。因此,綜合分析表明富民枳種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平較低,采取保護(hù)措施必須建立在最大程度保護(hù)其遺傳多樣性的基礎(chǔ)上。

3.2 基于富民枳遺傳多樣性研究的種質(zhì)保存和種群恢復(fù)評價

分析種群遺傳多樣性和確定有效種群規(guī)模是當(dāng)前保護(hù)遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容。國內(nèi)外基于遺傳多樣性分析提出了不同物種的保護(hù)措施[31-33],這些研究在比較各種分子標(biāo)記方法有效性的同時,根據(jù)種群間和種群內(nèi)的遺傳多樣性,提出了注重種群的保護(hù)策略[34-37]。前期研究用SSR分子標(biāo)記分析有效樣本量與遺傳多樣性指數(shù)的關(guān)系,結(jié)果顯示隨著有效樣本量的增加,富民枳遺傳多樣性隨之增加。有效樣本量小于29時,遺傳多樣性變化幅度較大,當(dāng)有效樣本量大于29時,遺傳多樣性趨于穩(wěn)定 (I=0.691 0±0.002 0),這說明利用遺傳多樣性指數(shù)來衡量富民枳種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平,至少需要29株。進(jìn)一步對現(xiàn)存富民枳遺傳多樣性分析結(jié)果進(jìn)行S型曲線擬合發(fā)現(xiàn),有效樣本量大于10時,遺傳多樣性才能達(dá)到90% (I=0.621 9)以上[23]。因此,無論開展天然種群保護(hù)還是人工種群的重建與恢復(fù),都應(yīng)在本研究 “65株”種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上,選取不少于10株的有效樣本材料 (或復(fù)本),就可以最大程度上保存富民枳現(xiàn)有種質(zhì)資源的遺傳多樣性。但是為了避免 “樣本量過多導(dǎo)致人力和物力的浪費”,應(yīng)盡量將種群的樣本量配置控制在“65株”有效種質(zhì)資源的29株 (或復(fù)本)以內(nèi)。

富民枳目前野外天然種群已經(jīng)滅絕,對其現(xiàn)存種質(zhì)資源的科學(xué)保護(hù)刻不容緩。從65份富民枳種質(zhì)資源材料的聚類圖看,可將其分為5大類。這5大類的植株分別來自7種、4種、6種、2種和2種種質(zhì)資源收集地,也就是說從C1到C10,富民枳的遺傳多樣性分別來自于聚類圖中的2(Ⅰ和Ⅲ)、 5(Ⅰ-Ⅴ)、 3(Ⅰ-Ⅲ)、 1(Ⅰ)、 0、 0、 4(Ⅰ～Ⅳ)、1(Ⅱ)、2(Ⅰ和Ⅲ) 和1(Ⅰ) 類,可以認(rèn)為C2和C7兩個種質(zhì)資源收集地的富民枳樣本的來源最豐富。另外,本研究對每個來源地的富民枳樣本分別進(jìn)行了遺傳多樣性分析,結(jié)果表明遺傳多樣性的差異性很大。其中,C2(I=0.626 6)、C4(I=0.640 8)、C7(I=0.641 7) 和C9(I=0.622 0)計4個地方的Shannon信息指數(shù)都達(dá)到總樣本的90%(I=0.621 9)以上,但是有效樣本量大于10的只有C2(30個有效樣本)和C7(27個有效樣本)兩個地方。綜合聚類圖分析結(jié)果,可以認(rèn)為只有人工回歸地C2和種質(zhì)資源收集地C7現(xiàn)階段的遺傳管理是有效的。

3.3 保護(hù)建議

基于對富民枳現(xiàn)存種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析結(jié)果,建議采取以下保護(hù)措施: (1)完善種質(zhì)資源收集地的資源配置。在8個未達(dá)到保護(hù)目標(biāo)的種質(zhì)資源收集地,從65株有效樣本聚類圖的每個亞類中選擇精選植株 (或其復(fù)本)進(jìn)行搭配,為保證每個收集地90%以上的遺傳多樣性,有效樣本量不少于10株,使得種質(zhì)資源保存合理化,同時降低富民枳DNA的位點純合率,避免近交衰退;(2)開展回歸引入,恢復(fù)天然種群。在前期建立人工種群1個基礎(chǔ)上,在天然種群鄰近區(qū)域,逐年回歸種植富民枳苗木,新建天然種群2-3個;(3)開展近地保護(hù)措施,建立其人工種群。在氣候相似、生境相似和群落相似的自然或半自然地段培植管護(hù)富民枳,并采集以種子為主的繁殖材料進(jìn)行資源配置,從65株有效樣本中選擇不少于10株的繁殖材料 (或其復(fù)本)作為精選群體重建種群;(4)開展相應(yīng)的監(jiān)測工作。對備份種質(zhì)和重建種群的遺傳多樣性變化及其幅度進(jìn)行監(jiān)測,以保證富民枳種質(zhì)資源收集地具有較高的遺傳多樣性水平。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明保存下來的富民枳遺傳多樣性水平較低。擬合樣本量與Shannon遺傳多樣性指數(shù)之間的S型曲線發(fā)現(xiàn),在有效樣本量為10時,遺傳多樣性達(dá)到群體水平的90%;在有效樣本量至少為29時,其遺傳多樣性基本能代表富民枳群體的遺傳水平。進(jìn)而評價了種質(zhì)保存基地和野外恢復(fù)種群的遺傳多樣性,9個種質(zhì)資源保存基地中只有1個保存基地達(dá)到保護(hù)目標(biāo),目前采取的種群恢復(fù)策略在遺傳水平上是有效的。本研究為實施富民枳其它科學(xué)保育策略的實施提供了理論基礎(chǔ)。