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(北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,北京 100083)
紫花苜蓿有“牧草之王”的美稱[1],因其適應(yīng)性、抗逆性及營養(yǎng)品質(zhì)突出而在世界廣泛栽培,在畜牧業(yè)中具有重要的作用。隨著品種單一化以及規(guī)?;图s化的生產(chǎn),苜蓿的病害也越來越嚴(yán)重,其嚴(yán)重地降低了牧草的品質(zhì)和產(chǎn)量[2],造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。苜蓿病害研究在我國起步較晚,直到上世紀(jì)70年代才開始進(jìn)行系統(tǒng)的研究[4],當(dāng)前多種病害研究資料依然匱乏,因此,加強(qiáng)苜蓿病害研究是我國苜蓿安全生產(chǎn)的重要保障之一。
苜蓿斑點(diǎn)病可嚴(yán)重降低苜蓿產(chǎn)量和飼用價值,鏈格孢菌(Alternariasp.)是苜蓿斑點(diǎn)病的病原菌之一。Naseri等[5]2000年在Kheirabad對生長期具有斑點(diǎn)病癥狀的苜蓿進(jìn)行了病原物分離,發(fā)現(xiàn)發(fā)病苜蓿植株的葉、莖、根等器官中均含有鏈格孢菌,并證明其可產(chǎn)生降低飼草品質(zhì)的真菌毒素。鏈格孢菌作為苜蓿斑點(diǎn)病的病原菌的描述記載較多[6-7],但國內(nèi)的系統(tǒng)研究報道目前還較少。2010年,國內(nèi)首次報道鏈格孢引起的苜蓿斑點(diǎn)病,并分離得到交鏈格孢(Alternariaalternata)[8]。由于鏈格孢屬分生孢子的形態(tài)學(xué)特征易受外界環(huán)境影響,因此根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察難以對鏈格孢屬進(jìn)行種級分類;但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,利用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS和 OPA2-1核苷酸序列對苜蓿斑點(diǎn)病鏈格孢屬病原菌種一級的分子鑒定已有報道[9]。
目前,交鏈格孢菌斑點(diǎn)病尚無抗性品種育出,因此主要依賴化學(xué)防治[10]??共∮N是防治病害提高牧草效益的核心手段之一。由于每一種病原物的致病機(jī)理都有其獨(dú)特的遺傳特性,則篩選出對應(yīng)病原物的抗性材料是培育抗病品種的關(guān)鍵。抗病篩選的方法主要有孢子懸浮液接種法和離體葉片接種法,前者具有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn),后者便于控制環(huán)境條件且差異明顯,都廣泛地用于抗病性評價[11-12]。除接種方法外,抗病相關(guān)酶活性變化的生理指標(biāo)也可用于抗病性評價[13]。苯丙氨酸解氨酶PAL是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶,參與多種抗菌化合物的合成。多項研究表明PAL酶活性與抗病性呈正相關(guān),因此苯丙氨酸解氨酶活性可用于抗病性評價[14]。
根據(jù)對北京林業(yè)大學(xué)順義草地植物實驗站中紫花苜蓿的病害調(diào)查,苜蓿斑點(diǎn)病發(fā)生極其嚴(yán)重,本研究對該實驗站中苜蓿斑點(diǎn)病的病原菌進(jìn)行了分離鑒定,并將其侵染21個紫花苜蓿品種,綜合評價這些品種對該病原菌的抗病性,為我國苜蓿斑點(diǎn)病的抗病性研究奠定基礎(chǔ),也為生產(chǎn)中選擇對苜蓿斑點(diǎn)病抗性強(qiáng)的苜蓿品種提供參考。
2017年4月11日于北京林業(yè)大學(xué)八家試驗地大田分區(qū)播種21個紫花苜蓿品種(表1),進(jìn)行常規(guī)田間養(yǎng)護(hù)。
表1 紫花苜蓿品種及編號Table 1 Alfalfa varieties and numbers
1.2.1采樣及病菌分離 2017年6月于北京林業(yè)大學(xué)順義草地植物實驗站采集苜蓿典型病樣,采用常規(guī)組織分離法[15]對病原菌進(jìn)行分離,多次純化獲得純菌株。
1.2.2病原菌分子鑒定 病原菌DNA提取利用試劑盒(OMEGA E.Z.N.ATM Fungal DNA Mini Kit)進(jìn)行。 采用真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[16]、小分子鏈格孢特異引物OPA2-1R(5’-TGCCGA GCTGTCAGATAATTG-3’)和OPA2-1F(5’-GCCGAG CTGGTGGAGAGAGT-3’)[17]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μl,DNA模板為1 μL,上下引物各1μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán),72℃延伸5 min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成,擴(kuò)增產(chǎn)物送該公司測序,測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行登錄和比對。
采用孢子懸浮液接種,參考袁慶華[11]等方法并加以改良,用血球計數(shù)板計算孢子濃度,制成濃度約為1×106個·ml-1的孢子懸浮液。
1.3.1離體葉片接種 參考李洪建[18]關(guān)于苜蓿莖點(diǎn)霉葉斑病的離體葉片接種方法,并稍作修改。選取無病且長勢良好的植株,以復(fù)葉為單位采集相同部位葉片,每個培養(yǎng)皿放置4片大小相似的復(fù)葉,每處理3皿,設(shè)3次重復(fù)。每天噴霧蒸餾水以保證培養(yǎng)皿內(nèi)濕度。
1.3.2田間接種 選取長勢一致、健康的苜蓿植株,采用孢子懸浮液噴霧接種,套袋遮光保濕24 h后去袋,對照噴霧等量蒸餾水,每處理10株,設(shè)3次重復(fù)。
1.3.3離體枝條水培接種 選取健康枝條于蒸餾水中水培,采用孢子懸浮液噴霧法接種,遮光保濕24 h后放置在27℃,80%濕度的光照培養(yǎng)箱中,于4天后取相同部位葉片測PAL酶活性。對照噴等量蒸餾水,設(shè)3次重復(fù)。
1.3.4病情測定
1.3.4.1 發(fā)病率
發(fā)病率的統(tǒng)計方法是發(fā)病葉片占總?cè)~片的比例。每天觀察發(fā)病情況。
1.3.4.2 分級標(biāo)準(zhǔn)
按每片小葉片病斑面積占總單片葉片面積的比例來分級測定病情。0級:無病斑;1級:病斑占葉片面積0~25%;2級:病斑占葉片面積26%~50%;3級:病斑占葉片面積51%~75%;4級:病斑占葉片面積76%~100%。
抗病級別實驗室離體葉片實驗病情指數(shù)<15為高抗,病情指數(shù)16~30為中抗,病情指數(shù)31~45為中感,病情指數(shù)>45為高感。
田間試驗擬抗病級別病情指數(shù)<5為高抗,病情指數(shù)5~10為中抗,病情指數(shù)10~15為中感,病情指數(shù)>15為高感。
1.3.5酶活性測定 PAL測定方法參考陳建隕[19]的方法,以每30 min A290增加0.01所需酶量為1個酶活性單位(U·g-1),使用UV-2600分光光度計測量。為了消除材料本身的差異和測量之間的誤差,本試驗所測定的酶活性采用相對酶活性:
相對酶活性(%)=接菌株系酶活性/未接菌株系酶活性×100%
1.3.6隸屬函數(shù)計算方法 利用公式求出具體函數(shù)值,Zij為i苜蓿品種的j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值,Xij為i苜蓿品種的j指標(biāo)值,Xjmin、Xjmax分別為21個供試品種j性狀指標(biāo)的最小值和最大值。當(dāng)j指標(biāo)與苜??共⌒猿烧嚓P(guān)時,用(1)式;反之,當(dāng)j指標(biāo)與苜??共⌒猿韶?fù)相關(guān)時用(2)式。
Zij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin) (1)
Zij=(Xjmax-Xij)/(Xjmax-Xjmin) (2)
把21個品種大田實驗測得的病情指數(shù)、離體葉片實驗測得的病情指數(shù)和枝條水培取樣測得的PAL酶活性指標(biāo)的隸屬函數(shù)值求平均值,值越大,抗性越強(qiáng);反之越小。利用各品種指標(biāo)隸屬值的大小來評價其抗病性強(qiáng)弱。
1.3.7數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Excel、SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖,采用one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。
經(jīng)實地調(diào)查分析,6月初苜蓿斑點(diǎn)病發(fā)生極嚴(yán)重,病葉占整個植株近70%,且所有植株都感病,感病植株表現(xiàn)出活力減弱,葉片萎黃;病斑正反面均為黑褐色,融合擴(kuò)大表現(xiàn)出與褪綠暈環(huán)繞的同心區(qū),周圍葉片黃化,表面平滑無凸出感,病斑直徑為0.1~0.6 mm,且病斑所占葉片面積按病害嚴(yán)重程度遞增,病情輕微的葉片僅葉尖發(fā)黃,嚴(yán)重時整個葉片發(fā)黃,對植株生長和苜蓿的品質(zhì)造成極大影響。
對采集的病葉分離純化,在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),菌落前期灰白色,后期呈墨綠色,有絮狀氣生菌絲,分生孢子梗單生或簇生,有分隔;在顯微鏡下觀察分生孢子呈梭形、倒棍棒型、長卵型。有2~5個橫隔,0~3個縱隔,大小約為20 μm×10 μm,隔膜處稍有縊縮。根據(jù)分生孢子的形態(tài)特征初步鑒定為鏈格孢屬真菌(Alternariasp.)。
圖1 苜蓿斑點(diǎn)病發(fā)病癥狀及病原形態(tài)特征Fig.1 The symptoms of alfalfa Leaf spot and morphology of isolated pathogen注:A:苜蓿斑點(diǎn)病病葉癥狀;B:病原菌落形態(tài);C:病原菌分生孢子(400×)Note:A:The symptom of alfalfa leaf spot;B:Isolation and culture of pathogen;C :Conidia(400×)
以病原菌DNA為模板,分別用ITS1/ITS4引物和OPA2-1L/OPA2-1R引物做PCR擴(kuò)增,電泳后紫外凝膠成像(圖2),條帶單一較亮,且無非特異性擴(kuò)增條帶,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。
圖2 真菌基因組的DNA PCR檢測電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis pattern of fungal genomic DNA PCR test
通過分析rDNA-ITS和rDNA-OPA2-1測序比對的結(jié)果,將得到的序列導(dǎo)入Genbank中進(jìn)行同源性比對,并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確認(rèn)致病菌是交鏈格孢菌(Alternariaalternata)。
擴(kuò)增的ITS序列結(jié)果(547bp):
A C C T G C G G A G G G A T C A T T A C A C A A A T A T G A A G G C G G G C T G G A A C C T C T C G G G G T T A C A G C C T T G C T G A A T T A T T C A C C C T T G T C T T T T G C G T A C T T C T T G T T T C C T T G G T G G G T T C G C C C A C C A C T A G G A C A A A C A T A A A C C T T T T G T A A T T G C A A T C A G C G T C A G T A A C A A A T T A A T A A T T A C A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A A A T G C G A T A A G T A G T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C T T T G G T A T T C C A A A G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T T G T A C C C T C A A G C T T T G C T T G G T G T T G G G C G T C T T G T C TC T A G C T T T G C T G G A G A C T C G C C T T A A A G T A A T T G G C A G C C G G C C T A C T G G T T T C G G A G C G C A G C A C A A G TC G C A C T C T C T A T C A G C A A A G G T C T A G C A T C C A C T A A G C C T T T T T T T C A A C T T T T G A C C T C G G A T C A G G T A G G G A T A C C C G C T G A A C T T A A G C A T A T C A
擴(kuò)增的OPA2-1序列結(jié)果(599bp):
C T G T C A G A T A A T T G A A G C T T T G A T G C T A A G A A A G T A G T T T A T T T G G T A T G A T G G T G G C T G T T G G G C G C A G C T A C C T T T A A G A A G G G T C C G C G A A G T T T A T G G C A A T G A G G T C A T G T C C G G T C T T T A C C G G C C A G C G C C A T T G T T G G G C G C G T C T C G T G C G A G T G C A T C G G G T G G A C G T G G G A C A C T G C A C C A T A G T A A C G C G A C G C G C T G C A T A C A C G C T G T T T G T C A G C C C A G G T G G C G T G A G G T A T C A G A T C T G C G G C G T G G T C T T G C T A C C G A A T G C G T G C G C T T G C A G C T C G A G G C T T C G T T T A C G C T C A C G A T T T T C T T C G T A C T A A C A C T G T T A T C G C G G C G T G G A A A T A A C T T G T A T C A A G C A C G A G A T T G T T G G T C A G A G T G G A A T C GA G A C A T T T G A A A G C G G G G C G C C T C G T G G G C C G T A C C A C T C C A T C C A C A T G T A T T T G G T C A A T C T G C A T C A T C A C C C G T C T A T C C A C A G C A G A A T C C C A A C A T T C A T C C A A G T C T G A A T T T T G C T A A T C A T A C A T C A G A A C G T G A A G A T C A C G A C C C A G C T C C C C G C A G C T T A T C T G C A G T C A T T T C C T G A A C T C T C T C C A C A A
離體葉片侵染后2~3 d有明顯發(fā)病葉片,8~10 d發(fā)病率趨于穩(wěn)定,10 d后測定病情指數(shù)(圖3)。
由圖3可知,21份材料的病情指數(shù)為5.79~53.01;品種間存在顯著差異(P<0.05),病情指數(shù)越小抗病性越強(qiáng),‘英斯特’病情指數(shù)5.79,抗病性最強(qiáng),其次是‘SK3010’病情指數(shù)6.02,‘北林201’病情指數(shù)7.87,‘皇冠’病情指數(shù)8.10;抗病性最弱的為‘新疆大葉’,病情指數(shù)高達(dá)53.01,其次是‘準(zhǔn)葛爾’病情指數(shù)50.46,‘維多利亞’病情指數(shù)40.05,‘肇東’病情指數(shù)38.43;將所有21個品種分為以下四個抗性水平,高抗水平(病情指數(shù)<15)的編號為:3,5,6,7,8,12,15,16,17;中抗水平(病情指數(shù)16~30)的編號為:2,1,4,9,10,11,13;中感水平(病情指數(shù)31~45)的品種編號為:14,18,21;高感水平(病情指數(shù)>45)的品種編號為:19,20。
圖3 離體葉片實驗不同苜蓿品種的病情指數(shù)Fig.3 Disease index of different alfalfa cultivars in vitro leaf experiments注:品種編號參考表1;不同小寫字母間差異顯著(P<0.05);下同Note: Varieties number in Table1. Different small letters (P<0.05) are significant different among the treatment. The same as below
大田實驗侵染一周后開始有病癥葉片,20 d后病情明顯測定病情指數(shù)(圖4)。
由圖4可知,21份材料的病情指數(shù)為0.49~29.75,品種間存在顯著差異(P<0.05)??剐宰顝?qiáng)的為‘威神’,病情指數(shù)0.49,‘皇冠’病情指數(shù)0.62,其次是‘SK3010’病情指數(shù)0.74,‘MF4020’和‘Tango’的病情指數(shù)均為1.11,最易感病的品種為‘新疆大葉’病情指數(shù)29.75,其次是‘耐鹽之星’病情指數(shù)26.79、‘準(zhǔn)葛爾’病情指數(shù)22.59。將所有21個品種分為以下四個抗性水平,高抗水平(病情指數(shù)<5)的品種編號為:2,3,5,6,7,8,13,14,15,16,17,18;中抗水平(病情指數(shù)5~10)的品種編號為:1,4,11,12,21;中感水平(病情指數(shù)10~15)的品種編號為:10;高感水平(病情指數(shù)>15)的品種編號為:9,19,20。
圖4 大田實驗不同苜蓿品種的病情指數(shù)Fig.4 Disease index of different alfalfa varieties in field experiments
枝條水培實驗的葉片侵染后4 d病癥初現(xiàn),各苜蓿品種葉片取樣測苯丙氨酸解氨酶活性(圖5)。
圖5 不同品種侵染后四天苯丙氨酸解氨酶(PAL)相對酶活性Fig.5 Relative enzyme activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) in four days after infestation of different cultivars
由圖5可知,品種間PAL相對酶活性存在顯著差異(P<0.05),其中‘英斯特’相對酶活性最強(qiáng),達(dá)到136%;其次是‘MT4015’,相對酶活性達(dá)131%;相對酶活性較低的是‘巨能7’和‘新疆大葉’,分別為82%和84%;‘巨能601’相對酶活性居中為100%。
利用生理生化指標(biāo)進(jìn)行抗病性鑒定是一種輔助性鑒定方法,許多研究表明,植物受到病原菌侵染后,一些代謝相關(guān)酶會發(fā)生一定的變化,這些變化與植物的抗病機(jī)制有關(guān)。多項研究表明[20],PAL活性與抗病性呈正相關(guān),因此可利用PAL活性來測定品種的抗病性,即PAL酶活性越高,抗病性也較強(qiáng)。由圖4可知,抗性較強(qiáng)(病情指數(shù)>110)的品種編號為:1,2,4,5,13,14,15,17,21;抗性中等(病情指數(shù)90~110)的品種編號為:3,6,7,9,11,12,16,19;抗性較弱(病情指數(shù)<90)的品種編號為:8,10,18,20。
不同紫花苜蓿種質(zhì)抗病強(qiáng)弱的程度可以通過隸屬函數(shù)值反映,值越大植株受病原菌影響越小,其抗病性就越強(qiáng);反之,隸屬函數(shù)值越小,植株受病原菌影響越大,抗病性越弱。通過隸屬函數(shù)法綜合大田侵染實驗的病情指數(shù)、離體葉片實驗的病情指數(shù)和PAL相對酶活性指標(biāo)進(jìn)行了評價,對21個紫花苜蓿品種進(jìn)行抗病性強(qiáng)弱的排序(表2),抗性由強(qiáng)至弱分別為‘英斯特’>‘MT4015’>‘北林201’>‘Tango’>‘威神’>‘皇冠’>‘巨能995’>‘SK3010’>‘斯貝德’>‘Dryland’>‘MF4020’>‘巨能2’>‘巨能801’>‘巨能601’>‘巨能7-耐望’>‘維多利亞’>‘巨能7’>‘肇東’>‘耐鹽之星’>‘準(zhǔn)葛爾’>‘新疆大葉’。
苜蓿有許多常見且危害嚴(yán)重的真菌病害,如霜霉病[21]、褐斑病[22]、銹病[23]、根腐病[24]等,近年來已有對這些病害進(jìn)行了系統(tǒng)研究[25]。張麗[14]從苜蓿葉部病害分離到的苜蓿真菌中鏈格孢的分離頻率最高,但是致病性較弱,因此該病菌引起的苜蓿病害易受研究者忽視。
2017年6月,本研究通過對北京林業(yè)大學(xué)順義草地植物實驗站紫花苜蓿的調(diào)查發(fā)現(xiàn)一種葉部病害發(fā)生嚴(yán)重,對苜蓿的品質(zhì)和產(chǎn)量造成了極大的影響,通過發(fā)病葉片的病斑觀察并結(jié)合顯微鏡下孢子形態(tài)觀察,初步確定病原菌為鏈格孢屬(Alternariasp.),通過查閱文獻(xiàn)確定該苜蓿病害為苜蓿斑點(diǎn)病[8-9]。傳統(tǒng)的菌種鑒定方法易受到環(huán)境和人為因素的影響而表現(xiàn)不穩(wěn)定且難以準(zhǔn)確鑒定到種。真菌DNA堿基具有穩(wěn)定性,借助PCR和測序等分子生物技術(shù)可以快速鑒定出真菌種類[25]。本實驗利用試劑盒提取了真菌DNA,分別利用引物ITS1/ITS4和OPA2-1R/OPA2-1F擴(kuò)增出真菌核糖體ITS片段(547 bp)和OPA2-1片段(599bp),經(jīng)過Genbank比對結(jié)果均為交鏈格孢(Alternariaalternata)。
利用分離培養(yǎng)的真菌進(jìn)行田間侵染、實驗室離體葉片法和水培枝條法侵染實驗,苜蓿發(fā)病癥狀均相似,葉尖發(fā)黃,病斑大小視嚴(yán)重程度而異,發(fā)病嚴(yán)重的葉片黃化、變干脫落(室外大田)、葉片變薄透明(離體葉片),采集病葉重新鑒定真菌,仍為交鏈格孢菌,利用柯赫氏法則保證了實驗的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)合大田侵染實驗和室內(nèi)侵染實驗,對21個紫花苜蓿品種對分離得到的鏈格孢做了抗性的初步研究,分析3種實驗方法,大田侵染、枝條水培侵染、離體葉片侵染后葉片病癥相似,但發(fā)病速度離體葉片>枝條水培>大田;離體葉片實驗易于控制100%濕度和最適宜孢子生長的溫度,3 d出現(xiàn)病癥,10 d發(fā)病率趨于穩(wěn)定;枝條水培實驗控制80%的濕度和最適宜溫度,4 d天侵染成功出現(xiàn)癥狀;大田實驗視環(huán)境不可控因素影響未能達(dá)到最適發(fā)病條件,發(fā)病癥狀沒有實驗室條件控制下明顯,一周之后葉片出現(xiàn)病癥,病情指數(shù)低于實驗室條件下病情指數(shù),但是大田侵染更接近自然發(fā)病條件,對于生產(chǎn)應(yīng)用有直觀的參考價值。
寄主植物與病原真菌的相互作用具有復(fù)雜性,利用生理生化指標(biāo)可作為抗病性評價的輔助性方法。本實驗利用苯丙氨酸解氨酶活性作為指標(biāo)參與抗病性評價。結(jié)果表明各苜蓿品種PAL酶活性存在顯著差異(P<0.05),與大田實驗和離體葉片實驗的病情指數(shù)評價抗感病結(jié)果存在極大相似度。
由于3種實驗的影響因素不同,所造成評價苜??共⌒缘挠绊懖町愡€有待研究。3種指標(biāo)所占的權(quán)重?zé)o法準(zhǔn)確衡量,利用模糊隸屬函數(shù)法,對3個指標(biāo)隸屬值求平均來綜合評價21個紫花苜蓿品種的抗病性強(qiáng)弱,抗性最強(qiáng)的是加拿大進(jìn)口的英斯特品種,抗性最弱的是本土新疆大葉品種,為生產(chǎn)中選擇對苜蓿斑點(diǎn)病抗性強(qiáng)的苜蓿品種提供了參考。此外,多品種的抗性差異,為深入研究紫花苜蓿對苜蓿斑點(diǎn)病的抗感機(jī)理奠定了基礎(chǔ),有利于今后深入研究抗病機(jī)理,減小鏈格孢菌產(chǎn)生的霉菌毒素和植物毒素對苜蓿生產(chǎn)造成的危害。