煙霧暴露對(duì)大鼠肺血管重塑及TLR-4表達(dá)的影響

吸煙是一種嚴(yán)重的社會(huì)危害,是慢性支氣管炎的重要致病因素,且近年來研究表明,煙霧不僅可導(dǎo)致氣管、支氣管的損害,而且可直接作用于肺血管,引起肺血管平滑肌異常增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移,導(dǎo)致肺血管重塑[1]。肺血管重塑是肺動(dòng)脈高壓的病理基礎(chǔ),其本質(zhì)是血管的慢性炎癥反應(yīng),也是疾病從慢性支管炎發(fā)展至肺心病、呼吸衰竭的重要病理過程[2]。Toll樣受體4(TLR-4)是一種天然免疫和被動(dòng)免疫的分子,通過與受體結(jié)合后激發(fā)大量炎癥因子的釋放而參與急性或慢性炎癥反應(yīng)。已有研究表明TLR-4在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞均有表達(dá),TLR-4/NF-κB信號(hào)通路可能促進(jìn)血管重塑[3]。為探討TLR-4與肺血管重塑的相關(guān)性,本研究制備煙霧暴露大鼠模型,觀察不同煙霧暴露量下大鼠肺部病理形態(tài)學(xué)和肺血管的變化及TLR-4蛋白、肺血管平滑肌增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白的改變,探討肺血管TLR-4的表達(dá)與肺血管重塑的關(guān)系,為吸煙后肺血管重塑的可能機(jī)制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)健康雄性3月齡SD大鼠40只,體質(zhì)量約180～200 g(由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng));CY-100B數(shù)字測(cè)氧儀,兔抗TLR-4多克隆抗體、小鼠抗PCNA單克隆抗體、PV600免疫試劑盒(均購(gòu)自武漢谷歌生物公司);奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司);HMIAS-2000彩色圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽浼皠?dòng)物分組 SD大鼠隨機(jī)分為:對(duì)照組(S1組),煙霧暴露4周組(S2組),煙霧暴露8周組(S3組),煙霧暴露12周組(S4組),每組各10只。對(duì)照組大鼠置于小鐵籠內(nèi),除常規(guī)喂養(yǎng)外不做其他處理;煙霧暴露大鼠在各組規(guī)定煙霧暴露時(shí)間內(nèi)放置于大小為100 cm×65 cm×45 cm的煙熏箱中,香煙每次10支,捆扎后點(diǎn)燃置于煙熏箱中的置物架上,煙熏箱中的氧濃度保持在20%～21%之間,用CY-100B數(shù)字測(cè)氧儀進(jìn)行監(jiān)測(cè),根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果開放煙熏箱的通氣孔。實(shí)驗(yàn)組大鼠每天煙霧暴露2次,2次暴露時(shí)間間隔>4 h。

1.3 病理標(biāo)本制作 各組大鼠到達(dá)造模時(shí)間干預(yù)點(diǎn)后,用1﹪戊巴比妥鈉(90 mg/kg)麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,放血處死后開胸,用 4%多聚甲醛經(jīng)氣管充分灌注直至胸膜,剪下右主支氣管,置于4%的中性甲醛中固定,取材、脫水,制成約4μm的石蠟切片,用于HE染色和免疫組化。

1.4 肺血管HE染色及病理學(xué)觀察 選取厚度約在4μm左右的病理切片,用蘇木精-伊紅法染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺泡和肺血管的病理學(xué)情況,每張切片隨機(jī)選取結(jié)構(gòu)較完整、橫斷面較圓且直徑約為50～200μm的肺動(dòng)脈5支,用HMIAS-2000型彩色圖文分析儀進(jìn)行測(cè)量,測(cè)量血管的內(nèi)徑、外徑,計(jì)算出血管壁厚度、血管壁面積及血管總面積,并計(jì)算管壁面積/血管總面積比值(WA%),血管壁厚度/血管外徑比值(WT%)。

1.5 肺動(dòng)脈TLR-4蛋白、PCNA蛋白的表達(dá) 采用PV6000二步法免疫組化染色法,選取厚度約4μm的病理切片,常規(guī)脫蠟水化,檸檬酸鈉抗原修復(fù),再用3%過氧化氫室溫孵育5～10 min,分別加兔抗TLR-4多克隆抗體、小鼠抗PCNA單克隆抗體,4 ℃過夜,后加顯色試劑顯色,整個(gè)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。在200倍視野下隨機(jī)選取每張切片上5條直徑約在100～200μm動(dòng)脈,采集圖像,用HMIAS-2000彩色圖文分析系統(tǒng),測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性染色動(dòng)脈的陽(yáng)性細(xì)胞率,計(jì)算出TLR-4及PCNA的平均積分吸光度(IA)。肺動(dòng)脈陽(yáng)性染色的判斷標(biāo)準(zhǔn):肺動(dòng)脈壁上出現(xiàn)棕黃色顆粒。以上操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 S1組肺泡排列較規(guī)則,肺泡及肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)基本正常,肺動(dòng)脈管壁薄且光滑,血管平滑肌排列均勻,較少增生,管壁及管腔周圍有較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。煙霧暴露組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)都有不同程度破壞,符合慢性支氣管炎改變:肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁變薄或斷裂,部分有融合。S2組肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞輕度增生,管壁欠光滑,管壁及周圍有少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn),S4組肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增生肥大,中膜層增厚,管腔狹窄,管壁及周圍可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(主要是單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等),S3組肺動(dòng)脈改變介于S2及S4組之間。見圖1。4組的WA%及WT%隨暴露時(shí)間的增長(zhǎng)而不斷升高，且各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠肺動(dòng)脈病理(HE染色,×200倍)

2.2 各組肺動(dòng)脈TLR-4蛋白、PCNA蛋白的表達(dá) TLR-4胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá),PCNA胞核呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。S1組肺動(dòng)脈較少陽(yáng)性染色,而隨著煙霧暴露時(shí)間增加,S2、S3、S4組肺動(dòng)脈染色逐漸加深。見圖2,3。

4組間,TLR-4蛋白、PCNA蛋白表達(dá)水平均隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而增高,且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺血管WA% 、WT% 、TLR4、PCNA表達(dá)結(jié)果

注：與S1組比較,*P<0.05；與S2組比較,△P<0.05;與S3組比較,▲P<0.05

圖2 各組大鼠肺動(dòng)脈TLR-4免疫組化染色結(jié)果(×200倍)

圖3 各組大鼠肺動(dòng)脈PCNA免疫組化染色結(jié)果(×200倍)

2.3 相關(guān)性分析 TLR-4蛋白表達(dá)量與WA%、WT%、PCNA均呈正相關(guān)(r=0.815、0.769、0.713,P均<0.01)。

3 討論

煙霧刺激、大氣污染、細(xì)菌感染等是慢性支氣管炎的重要發(fā)病因素。有研究提出煙霧可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬酶等血管活性介質(zhì)調(diào)節(jié)來介導(dǎo)肺泡和肺血管損傷,導(dǎo)致氣管及血管重塑,從而引起其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,誘發(fā)慢性支氣管炎、肺心病等疾病的發(fā)生[4]。本實(shí)驗(yàn)制備煙霧暴露模型,HE染色提示煙霧暴露組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)較對(duì)照組紊亂,血管壁周圍出現(xiàn)炎性細(xì)胞,血管平滑肌出現(xiàn)不同程度增生,血管壁增厚或管腔變形,以吸煙12周組改變最為明顯。煙霧暴露組大鼠肺部改變提示煙霧暴露導(dǎo)致慢性支氣管炎的發(fā)生,且引起血管重塑,這與文獻(xiàn)報(bào)道是相符合的[5-6]。流行病學(xué)提示煙霧中的一氧化碳(CO)、尼古丁、含硫化合物等有害氣體及有毒顆粒是多種呼吸道疾病的誘因,也是動(dòng)脈硬化、高血壓、肺心病的致病因素,但煙霧致肺血管重塑機(jī)制不甚明確。本研究中煙霧暴露組大鼠WA%、WT%水平較對(duì)照組明顯增高,表明肺血管重塑程度隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而加重。

近年來研究發(fā)現(xiàn),免疫應(yīng)答可啟動(dòng)炎癥介質(zhì)釋放,促使血管平滑肌增生及新生血管形成,加劇血管重塑,TOLL家族在其中發(fā)揮了重要作用[7]。TLR-4是近年來發(fā)現(xiàn)的與肺部疾病關(guān)系密切的新型免疫分子。國(guó)內(nèi)外研究成果提示TLR-4存在于氣道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等,且主要表達(dá)于細(xì)胞基底膜,其最主要生物學(xué)功能就是引發(fā)炎癥反應(yīng)[8]。核因子(NF)-κB作為TLR-4下游最為重要的轉(zhuǎn)錄基因,煙霧、細(xì)菌脂多糖、感染等外界刺激到達(dá)后,激活TLR-4/NF-κB信號(hào)通路,引起相應(yīng)免疫基因的活化,誘導(dǎo)白介素-1(IL-1)、IL-6等前炎癥因子,LTB-4、C5a等趨化因子及血小板源生長(zhǎng)因子等的分泌和釋放[9]。目前已有研究證實(shí)，TLR-4參與氣道重塑及氣道高反應(yīng)性的調(diào)節(jié),影響氣道黏液的高分泌,而且在血管重塑中發(fā)揮主導(dǎo)作用[10]。

TLR-4參與血管慢性炎癥反應(yīng)以及血管重塑早有報(bào)道。有文獻(xiàn)報(bào)道TLR-4影響小鼠胸主動(dòng)脈的血管內(nèi)皮素、細(xì)胞間黏附分子-1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞因子的分泌,加重血管肌化程度,誘導(dǎo)高血壓小鼠的血管重塑,且可能機(jī)制是通過TLR-4/NF-κB信號(hào)活化后實(shí)現(xiàn)的[11];伏俊等[12]發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病病人的肺血管重塑與煙霧刺激后TLR-4水平增高,過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPAR-γ)等炎癥因子釋放增加而引起血管平滑肌增殖有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果提示:煙霧暴露組TLR-4表達(dá)量、PCNA表達(dá)量都顯著高于對(duì)照組,且隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng),它們?cè)诜窝苤械谋磉_(dá)量均呈時(shí)間依賴性增高,且兩者之間亦呈正相關(guān)。由此我們推測(cè)煙霧暴露可提升TLR-4表達(dá),TLR-4可能參與肺血管重塑,其機(jī)制可能與誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)。同時(shí)，各組大鼠肺血管TLR-4水平與WA%、WT%均呈正相關(guān),表明TLR-4表達(dá)與肺血管重塑程度呈正相關(guān)。而Lee等[13]發(fā)現(xiàn)煙霧可以激活TLR-4在肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)并誘導(dǎo)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),且檢測(cè)到不同煙霧刺激下TLR-4水平是不一樣的,而對(duì)哮喘的研究也提示香煙煙霧提取物在支氣管哮喘大鼠中能夠誘導(dǎo)TLR-4/NF-κB的活化,上調(diào)細(xì)胞間黏附分子-1等細(xì)胞因子的表達(dá)而加重支氣管重塑,且氣道重塑程度跟TLR-4水平正相關(guān)[14]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,TLR-4在煙霧暴露大鼠肺血管中有表達(dá),且其表達(dá)水平與煙霧暴露量及血管重塑程度正相關(guān)。

綜上所述,煙霧暴露可上調(diào)TLR-4水平,誘導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞異常增殖,導(dǎo)致肺血管重塑程度加重。這可能是吸煙引起肺血管重塑的機(jī)制之一。