中國荷斯坦牛TLR2基因SNPs的快速篩查及等位基因頻率的估算

楊永江，吳恩蕓，任穩(wěn)穩(wěn)，馬博妍，高成宏，李宏旭，劉麗霞，曹 忻，臧榮鑫，楊具田，張 麗

(西北民族大學 生命科學與工程學院， 甘肅 蘭州 730030)

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是一類在生物進化過程中較保守的模式識別受體，能對感染機體的病原微生物直接做出免疫防御，在天然免疫防御中發(fā)揮重要作用[1]。TLRs能夠直接識別不同微生物表面的病原相關(guān)分子模式，激活先天免疫應(yīng)答[2]。作為TLRs家族成員，TLR2通過識別多種病原微生物及其產(chǎn)物，介導天然免疫，并且通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，啟動獲得性免疫，其在巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞和T淋巴細胞等多種免疫細胞表面均有表達[3]。研究證實，TLR2受體能夠識別大多數(shù)病原微生物及其產(chǎn)物，能夠識別革蘭陽性菌的肽聚糖和脂磷壁酸，革蘭陰性菌的類脂A、分支桿菌和脂蛋白與脂肽和細菌DNA等[4]，但TLR2不直接識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，而是和TLR6形成異源二聚體來提高TLR6對PAMPs的識別能力[5]。有研究顯示，荷斯坦牛TLR2基因含有豐富的多態(tài)性，并與乳腺炎抗性顯著相關(guān)[6]。

牛TLR2基因位于17號染色體[7]，基因全長13 226 bp，mRNA序列全長3 513 bp，編碼784個氨基酸，共有2個外顯子，其中第2外顯子為TLR2蛋白的編碼區(qū)。牛TLR2基因多集中于該基因與奶牛乳腺炎的相關(guān)性研究。研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因通過識別金黃色葡萄球菌和鏈球菌，激活NF-kB通路，釋放炎性因子，從而導致乳房炎的發(fā)生?；疾∨Ｈ橄賲^(qū)域TLR2 mRNA的表達量顯著高于正常牛乳腺區(qū)域mRNA的表達，TLR2基因表達量可增至4～13倍[8-9]。另外，乳房炎作為奶牛常見病之一，嚴重影響了我國乳業(yè)的發(fā)展。TLR2基因單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphisms，SNPs)可作為荷斯坦牛乳房炎抗性的候選功能性SNP位點[10-12]。本研究利用DNA池測序?qū)χ袊伤固古LR2基因SNP進行快速篩查，旨在尋找奶牛TLR2基因的新型分子標記，以開發(fā)奶牛抗乳房炎的候選功能性SNP。

1 材料與方法

1.1 血樣采集及DNA池的構(gòu)建

血樣采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司的350頭荷斯坦牛，采集尾靜脈血10 mL。以苯酚-氯仿法抽提基因組DNA[13]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA完整性，紫外分光光度計測量每個DNA樣品濃度3次，取平均值，加雙蒸水調(diào)整DNA樣品濃度至100 ng·μL-1，各DNA樣品吸取2 μL構(gòu)建DNA池。

1.2 引物設(shè)計和PCR擴增

使用Primer6.0軟件在牛TLR2基因(NM_174197)上設(shè)計4對特異性引物(表1)，交由蘇州金唯智生物有限公司合成。PCR擴增體系為40 μL，含DNA池模板2.0 μL，0.25 μmol·L-1上下游引物各0.8 μL，2×TaqPCR Master Mix 22.0 μL，蒸餾水14.8 μL。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，2%瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.3 等位基因頻率估算

1.4 生物信息學分析

對中國荷斯坦牛TLR2基因編碼區(qū)生物信息學分析按照參考文獻[15]的在線軟件進行。

表1 牛TLR2基因SNP檢測用引物列表Table 1 The information of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 荷斯坦牛TLR2基因DNA池PCR擴增結(jié)果

DNA池P1、P2、P3、P4引物擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示(圖1)，擴增產(chǎn)物條帶清晰明亮，條帶單一，擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期目的片段長度相符。

M，DNA marker 600 bp；1，P1引物擴增結(jié)果；2，P2引物擴增結(jié)果；3，P3引物擴增結(jié)果；4，P4引物擴增結(jié)果。M, DNA marker 600 bp; 1, P1 primer amplification results; 2, P2 primer amplification results; 3, P3 primer amplification results; 4, P4 primer amplification results.

2.2 DNA池擴增產(chǎn)物序列測定

中國荷斯坦牛DNA池P1、P2、P3和P4引物PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與牛TLR2基因標準序列(NM_174197)進行比對后共發(fā)現(xiàn)6個SNPs(圖2)，其中P1引物檢測到TLR2基因第2內(nèi)含子602 bp處發(fā)生T→A的突變(命名為T602A)； P3引物檢測到TLR2基因第2外顯子10 634 bp處發(fā)生T→G的突變(T10634G)，10 900 bp處發(fā)生G→C的突變(G10900C)，T10634G為錯義突變(Gly63Asp)；P4引物檢測到中國荷斯坦牛TLR2基因第2外顯子11 047、11 096、12 077 bp處發(fā)生G→C、G→C、A→T和C→T的突變，分別命名為G11047C、A11076T、C12077T，均屬于同義突變。其中T602A、T10634G、G10900C為牛TLR2基因首次發(fā)現(xiàn)的SNP位點。

2.3 SNPs篩查及等位基因頻率估算

利用MWSnap軟件標尺測量中國荷斯坦牛測序峰圖中各SNPs等位基因峰圖高度，并估算各突變位點的等位基因頻率(表2)。由表2可知，等位基因頻率在突變前后有明顯差異。

圖2 TLR2基因6個SNP測序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of six SNP of TLR2 gene in Holstein cattle

表2 牛TLR2基因6個SNP等位基因頻率估算Table 2 Estimation of 6 SNP alleles in the cattle TLR2 gene

2.4 中國荷斯坦牛TLR2基因SNPs對mRNA二級結(jié)構(gòu)的影響

外顯子2處的突變位點T10634G進行mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明，SNPs突變前后引起mRNA二級結(jié)構(gòu)改變，并導致mRNA二級結(jié)構(gòu)的最小自由能發(fā)生改變，如圖3所示。T10634G位點突變前后的自由能由-677.00 kcal·mol-1變?yōu)?683.60 kcal·mol-1，影響mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可能影響隨后蛋白質(zhì)的翻譯過程。

2.5 突變前后荷斯坦牛TLR2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

使用在線軟件http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html分析荷斯坦牛TLR2基因SNPs對蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果如圖4所示。其中T10634G野生型α-螺旋(Hh)、β-折疊(Ee)、β-轉(zhuǎn)角(Tt)和無規(guī)則卷曲(Cc)比例分別為46.30%、17.86%、7.02%和28.83%，突變型則為45.79%、18.49%、7.02%和28.70%。

通過ESypred3D Web Server 1.0同源建模對TLR2蛋白進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，得到預(yù)測的TLR2膜外區(qū)的立體三維結(jié)構(gòu)(圖5)。預(yù)測結(jié)果表明，TLR2膜外區(qū)蛋白由背面多個α-螺旋和內(nèi)面多個β-折疊構(gòu)成，α-螺旋和β-折疊平行交替排列，構(gòu)成一個彎曲狀螺旋結(jié)構(gòu)；突變前后TLR2蛋白三級結(jié)構(gòu)無明顯改變。

h, α螺旋； e, β折疊； t, β-轉(zhuǎn)角; c, 無規(guī)則卷曲。h， Alpha helix; e， Extended strand; t， Beta turn; c， Random coil.

圖中黑色代表α螺旋(Alpha helix)，深灰色代表β折疊(Extended strand)，淺灰色代表β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲(Beta turn and Random coil)。Black represents alpha helix; Dark grey represents beta folding; Light grey represents Beta turn and random coil.圖5 荷斯坦牛TLR2 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測Fig.5 Putative result of TLR2 protein tertiary structure in Holstein cattle

3 討論

3.1 中國荷斯坦牛TLR2基因SNPs快速篩查及等位基因頻率分析

Toll樣受體(TLRs)是一類病原模式識別受體基因，是連接特異性免疫和非特異性免疫的橋梁。雞體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)10種TLRs，可識別廣泛的病原微生物及其代謝物，與禽類的抗病力顯著相關(guān)[16]。哺乳動物及人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員有11個，其中TLR2可以促進細胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在一定的條件下，脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)可激活TLR2信號途徑，產(chǎn)生促凋亡蛋白(Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD)和Caspase-8，導致表達TLR2的細胞發(fā)生凋亡，從而可降低過度的免疫應(yīng)答，調(diào)控機體對入侵病原體的免疫應(yīng)答在適度的水平[17]。

SNP是染色體基因組中單個核苷酸堿基以顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等形式突變所引起的DNA序列的多態(tài)性，哺乳動物基因組平均每300～1 000 bp就有1個SNP，SNP不僅是基因組水平上最常見的遺傳變異類型，還具有多態(tài)性豐富和遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點。

目前對牛TLR2基因的SNP研究多集中于該基因外顯子2區(qū)域，劉利等[12]在荷斯坦牛TLR2基因的外顯子2區(qū)域發(fā)現(xiàn)5個SNP位點，其中G11047C、A11076T也在本次多態(tài)性篩查中出現(xiàn)；白杰等[19]在荷斯坦牛TLR2基因的外顯子2區(qū)域上發(fā)現(xiàn)T10634G突變，為錯義突變，氨基酸由天冬氨酸(Asp)突變?yōu)楣劝彼?Gly)。

另外，不同群體的牛TLR2 SNP研究也呈現(xiàn)不同的研究結(jié)果，Pant等[20]在加拿大荷斯坦公牛群體中沒有檢測到TLR2基因的多態(tài)位點；白杰等[19]在新疆褐牛和中國荷斯坦奶牛群體中發(fā)現(xiàn)3個SNPs，其中A12705T位點為本研究未發(fā)現(xiàn)位點，而A11076G位點發(fā)生的三等位基因錯義突變在本研究中為A11076T為雙等位基因位點，且為同義突變。本研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果與白杰等[19]的研究結(jié)果存在較大差異。本研究顯示，DNA池測序法可用于SNP的高效篩查[18]，利用DNA池測序法，我們在荷斯坦牛TLR2基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)了6個SNPs，分別為T602A、G10900C、G11047C、A11076T、C12077T和T10634G，其中T602A、T10634G、G10900C為牛TLR2基因首次發(fā)現(xiàn)的SNP位點，T10634G為錯義突變，氨基酸由原來的谷氨酸(Gly)轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?Asp)，這與白杰等[19]的研究結(jié)果不同，造成差異過大可能是所選擇的奶牛群體不同所造成的，寧夏和新疆、加拿大地區(qū)的環(huán)境、管理和選育模式的差異在一定程度上也會影響奶牛的遺傳背景。

同義突變對基因功能的影響要比錯義突變影響小，同義突變雖然不影響編碼的氨基酸序列，但同義突變可能引起外顯子的拼接增強，從而影響蛋白質(zhì)的表達量，在一定程度上會改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，進而影響該蛋白質(zhì)的正常功能[21]。錯義突變能顯著引起氨基酸的改變，通過影響編碼的氨基酸序列來影響蛋白質(zhì)的功能。

3.2 中國荷斯坦牛TLR2蛋白質(zhì)及SNPs生物信息學分析

基因外顯子的核苷酸突變可能引起 mRNA二級結(jié)構(gòu)的改變，從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，進而影響其生物學功能。荷斯坦牛TLR2基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，SNP位點可影響基因mRNA二級結(jié)構(gòu)和自由能，影響mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，如T10634G突變前后的自由能降低了6.60 kcal·mol-1，T10634GT→G的變異可增加mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而這種改變可能引起TLR2基因表達效率的改變，相關(guān)結(jié)論仍需要實驗的進一步證實。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指在它的多肽鏈中有一些規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角，有效地對其進行預(yù)測和分析有助于研究該蛋白質(zhì)功能。TLR2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占主導地位，荷斯坦牛TLR2預(yù)測結(jié)果顯示二級結(jié)構(gòu)中Hh>30%，Ee>15%，由此可推測荷斯坦牛TLR2蛋白為混合型二級結(jié)構(gòu)[27]。T10634G的突變可引起編碼氨基酸的改變，使TLR2蛋白α-螺旋(Hh)由46.30%降低至45.79%，β-折疊(Ee)由17.86%增加至18.49%，無規(guī)則卷曲(Cc)由28.83%降低至28.70%。由于α螺旋和無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體受體結(jié)合的活性部位，無規(guī)則卷曲易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象[28]，因此TLR2基因T10634G突變可能會對蛋白二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性造成影響，具體結(jié)論仍需進一步研究。

本研究利用DNA池測序?qū)伤固古LR2基因的SNP進行了高效篩查，在此基礎(chǔ)上我們將進行各SNPs與奶牛乳房炎的關(guān)聯(lián)分析，以期為荷斯坦牛的抗病育種提供理論基礎(chǔ)。