一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定穿心蓮分散片中4種內(nèi)酯類成分的含量

姜志遠(yuǎn)，劉世萍，馬妍妍，李業(yè)雨

(1.黑龍江省農(nóng)墾總局疾病預(yù)防控制中心，黑龍江 哈爾濱 150090；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150001)

穿心蓮分散片是由穿心蓮藥材經(jīng)提取物后，加入適當(dāng)?shù)妮o料制備的速釋片劑，具有清熱解毒、涼血消腫的藥理作用，在臨床上廣泛地應(yīng)用于邪毒內(nèi)盛，感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，口舌生瘡。穿心蓮分散片的藥效成分有穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等二萜類內(nèi)酯化合物。目前穿心蓮分散片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只設(shè)定穿心蓮內(nèi)酯的含量限值，無(wú)法滿足穿心蓮分散片的質(zhì)量控制要求。由于片劑的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制需要大量的化學(xué)對(duì)照品，同時(shí)二萜類內(nèi)酯對(duì)照品的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、不易制得、價(jià)格昂貴等原因，因此對(duì)穿心蓮分散片的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)，在實(shí)際生產(chǎn)中很難推廣。本實(shí)驗(yàn)以含量較高、性質(zhì)穩(wěn)定的穿心蓮內(nèi)酯為參照物, 建立穿心蓮分散片4種內(nèi)酯類成分同步測(cè)定的一測(cè)多評(píng)法, 實(shí)現(xiàn)降低檢測(cè)成本, 提高含量檢測(cè)的質(zhì)量和效率的目的,為穿心蓮分散片的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制提供理論依據(jù)和參考方法。

1 儀器與試劑

1.1 藥品試劑

穿心蓮分散片(黑龍江烏蘇里江制藥有限公司哈爾濱分公司提供，規(guī)格:0.55 g/片，批號(hào)為20170301、20170302、20170303、20170304、20170401、20170402)。對(duì)照品穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào):110797-201609)、脫水穿心蓮內(nèi)酯(批號(hào):110854-201710)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品購(gòu)于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心(經(jīng)HPLC檢測(cè)，面積歸一化法計(jì)算,純度>98%)。色譜純乙腈(Merck公司生產(chǎn)),實(shí)驗(yàn)用水為自制的超純水,其他的檢測(cè)試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1100 型高效液相色譜儀，配有四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器；SHIMADZU LC-2010AHT型液相色譜儀(日本島津制作所)；Phemomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱、Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱、YMC-Pack C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；BS210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；KQ-600型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FiveEasy Plus型pH計(jì)(METTLER TOLEDO公司)；Milli-Q A10型超純水系統(tǒng)(默克密理博公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)的實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：PhemomenexC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水,梯度洗脫:0～52 min,20%～40%乙腈；52～65 min,40%～80%乙腈；流速1.2 mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm；進(jìn)樣量10 μL。內(nèi)酯混合對(duì)照品和穿心蓮分散片的HPLC圖見(jiàn)圖1。

圖1 內(nèi)酯混合對(duì)照品(A)和穿心蓮分散片樣品(B)HPLC圖

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取穿心蓮的4種內(nèi)酯對(duì)照品適量，加入甲醇配制成每1 mL中含穿心蓮內(nèi)酯0.042 1 mg,新穿心蓮內(nèi)酯0.054 6 mg,去氧穿心蓮內(nèi)酯0.053 8 mg,脫水穿心蓮內(nèi)酯0.082 2 mg的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

取穿心蓮分散片10片，除去包衣，研細(xì)，取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，振搖使其分散均勻，室溫下浸泡1 h，置數(shù)控超聲波清洗器內(nèi)超聲處理30 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，振搖使其混合均勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，置中性氧化鋁柱(200～300目，5 g，柱內(nèi)徑為1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 內(nèi)酯成分的線性關(guān)系考察

取2.1.2項(xiàng)下的穿心蓮內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、12、15、20 μL，測(cè)定內(nèi)酯的峰面積。以內(nèi)酯的峰面積(A)對(duì)進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 穿心蓮分散片中4種內(nèi)酯成分的線性關(guān)系

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取2.1.2項(xiàng)下的穿心蓮內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣10 μL，記錄內(nèi)酯成分的峰面積。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等4種成分峰面積的RSD值分別為0.27%,0.34%,0.65%,0.41%,表明儀器精密度良好。

2.1.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取穿心蓮分散片(批號(hào)：20170301)，按2.1.3項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，室溫放置，在0、2、4、8、12、16、24 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄4種內(nèi)酯類成分的峰面積，結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等4種成分峰面積的RSD值分別為0.37%, 0.52%,0.78%,0.42%, 說(shuō)明穿心蓮分散片的供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取穿心蓮分散片(批號(hào)：20170301)，按2.1.3項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，平行配制6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄4種內(nèi)酯類成分的峰面積。通過(guò)計(jì)算得到，穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等4種內(nèi)酯成分的含量分別為19.56,15.93, 22.27和21.42 mg/g,RSD值分別為0.35%,0.51%,0.86%和0.44%,說(shuō)明設(shè)定的提取方法和檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的穿心蓮分散片(批號(hào)：20170301)細(xì)粉0.2 g，精密加入等量的內(nèi)酯混合對(duì)照品, 按2.1.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液, 依法測(cè)定4種內(nèi)酯成分的含量并計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等4種成分的平均加樣回收率分別為99.07%,98.29%,96.73%,99.24%；RSD值分別為0.36%,0.42%,0.83%,0.75%,說(shuō)明設(shè)定的提取方法和檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2 內(nèi)酯成分的相對(duì)校正因子計(jì)算

取2.1.2項(xiàng)下的穿心蓮內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件精密進(jìn)樣2、5、10、15、20 μL，測(cè)定4種內(nèi)酯類成分的峰面積。然后以穿心蓮內(nèi)酯為參照物, 根據(jù)公式Fr= (An×Ws) / (As×Wn)分別計(jì)算新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等3種待測(cè)成分的相對(duì)校正因子,式中Fr、An、Ws、As、Wn分別為相對(duì)校正因子、參照成分的峰面積及其質(zhì)量濃度(mg/mL)、待測(cè)成分的峰面積及其質(zhì)量濃度(mg/mL)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穿心蓮分散片中3種待測(cè)皂苷類成分的相對(duì)校正因子

2.3 內(nèi)酯成分的相對(duì)校正因子重復(fù)性考察

2.3.1 不同的檢測(cè)儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響

考察不同品牌的2種色譜儀及3種色譜柱(規(guī)格均為:250 mm×4.6 mm,5 μm)對(duì)穿心蓮分散片的4種內(nèi)酯類成分相對(duì)校正因子的影響, 結(jié)果相對(duì)校正因子的RSD<2%, 表明使用不同品牌的檢測(cè)儀器及色譜柱均具有良好的重現(xiàn)性。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 待測(cè)成分色譜峰的定位

以穿心蓮內(nèi)酯的保留時(shí)間為定位標(biāo)準(zhǔn), 計(jì)算新穿心蓮內(nèi)酯等3種待測(cè)成分在不同品牌色譜儀及色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間的RSD<2%, 說(shuō)明在不同色譜儀和色譜柱下，相對(duì)保留時(shí)間的變化值較小, 重現(xiàn)性良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 樣品的含量測(cè)定

按設(shè)定的含量測(cè)定方法，用一測(cè)多評(píng)法(QAMS)與外標(biāo)法(ESM)同時(shí)測(cè)定6批穿心蓮分散片樣品中穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯等4種成分的含量。結(jié)果表明，QAMS法測(cè)得的含量數(shù)據(jù)與ESM法測(cè)得的結(jié)果無(wú)顯著差異(RSD<2%)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 不同的液相色譜儀及色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子

表4 不同的液相色譜儀及色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間

表5 穿心蓮分散片中4種內(nèi)酯成分的含量測(cè)定比較結(jié)果表(mg/mL)

3 討論

穿心蓮分散片的化學(xué)成分比較單一,主要為二萜內(nèi)酯類的4種成分。這些成分在同一色譜系統(tǒng)中的出峰時(shí)間及峰形等也會(huì)受到色譜柱、溶劑、柱溫等諸多因素的影響，因此,待測(cè)成分色譜峰的定位非常重要，關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)采用穿心蓮內(nèi)酯的保留時(shí)間作為待測(cè)成分的定位標(biāo)準(zhǔn)，穿心蓮內(nèi)酯類成分的相對(duì)保留時(shí)間在不同的檢測(cè)儀器及色譜柱條件下重現(xiàn)性較好(RSD值<2.0% )。

通過(guò)方法學(xué)研究，不同品牌的2種色譜儀及3種色譜柱對(duì)穿心蓮分散片內(nèi)酯類成分的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間影響較小 (RSD<2%)。6批穿心蓮分散片樣品的含量測(cè)定結(jié)果表明: QAMS法測(cè)得的含量數(shù)據(jù)與ESM法測(cè)得的結(jié)果無(wú)顯著差異,說(shuō)明建立的QAMS法可對(duì)穿心蓮分散片的4種內(nèi)酯類成分的含量可以實(shí)現(xiàn)同步測(cè)定, 為穿心蓮分散片的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)和參考方法。