陜北白絨山羊小反芻獸疫疫苗免疫后抗體水平檢測(cè)

郝玉青,高 嫻,王利榮,劉健鵬, 白崇生,孫巖,白艷艷*

(1.榆林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,陜西榆林 719000;2.榆林市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西榆林 719000)

小反芻獸疫(Peste des petis ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petis ruminants virus,PPRV)引起的一種山羊、綿羊等小反芻獸類的急性接觸傳染性病，發(fā)病率和病死率均較高[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。2014年4月3日榆林市定邊縣鹽場(chǎng)堡鎮(zhèn)賈圈村發(fā)生一起疑似小反芻獸疫疫情，4月5日該疫情得到國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心確診[2]，標(biāo)志著小反芻獸疫已傳入榆林市。該病尚無(wú)有效治療方法，主要通過(guò)早期診斷和疫苗免疫接種進(jìn)行防控[3]。小反芻獸疫作為外來(lái)新病種在免疫接種相關(guān)知識(shí)上存在較大空白，缺乏理論依據(jù)，憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行大面積接種推廣疫苗存在一定風(fēng)險(xiǎn)，該疫苗使用的實(shí)際效果成為了全市業(yè)內(nèi)人員及養(yǎng)羊戶最為關(guān)心的問(wèn)題之一。本研究對(duì)在榆林地區(qū)陜北白絨山羊免疫接種小反芻獸疫疫苗的安全性、首免時(shí)間、免疫效果和免疫抗體持續(xù)期進(jìn)行研究,初步確定了PPR的免疫效果及安全性，為本地區(qū)大面積的免疫接種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 榆陽(yáng)區(qū)馬合鎮(zhèn)陜北白絨山羊種羊場(chǎng)基礎(chǔ)繁殖母羊，試驗(yàn)羊只臨床檢查健康、無(wú)臨床疾病表現(xiàn)。試驗(yàn)羊按規(guī)范進(jìn)行飼養(yǎng)和管理，精飼料為配合飼料，粗飼料為青干草，為舍飼飼養(yǎng)。試驗(yàn)羊只未接種過(guò)小反芻獸疫疫苗，基礎(chǔ)抗體為陰性。

1.1.2 疫苗 小反芻獸疫弱毒疫苗，新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)，每頭份疫苗含有的小反芻獸疫弱毒病毒不低于103TCID50，免疫持續(xù)期暫定為36個(gè)月。

1.1.3 診斷試劑盒 小反芻獸疫間接ELISA試劑盒(批號(hào)：2014061802)，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；小反芻獸疫金標(biāo)檢測(cè)試劑卡(批號(hào)：2014061802)，購(gòu)自北京信諾生物有限公司；小反芻獸疫阻斷ELISA試劑盒購(gòu)(批號(hào)201606、201701、201706)，購(gòu)自青島立見(jiàn)生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫羊臨床安全性觀察 榆林地區(qū)PPR春季防疫免疫后，對(duì)全市免疫羊群進(jìn)行疫苗安全性問(wèn)卷調(diào)查或走訪；對(duì)試驗(yàn)組羊臨床觀察，制定免疫后飼養(yǎng)臨床觀察日志，觀察接種后15 d內(nèi)羊只有無(wú)過(guò)敏反應(yīng)、局部不適、全身不良反應(yīng)等現(xiàn)象，并記錄接種后5個(gè)月內(nèi)出生羔羊的發(fā)育、成活率等情況。

1.2.2 不同免疫方法的抗體檢測(cè) 選取成熟且配耳標(biāo)的未免疫母羊60只，隨機(jī)分A、B、C、D 4個(gè)圈飼養(yǎng)，A圈20只羊頸部皮下注射1倍劑量PPR疫苗，B圈20只羊頸部肌肉注射1倍劑量PPR疫苗，C圈16只羊頸部皮下注射2倍劑量PPR疫苗，D圈4只對(duì)照組羊未免疫。免疫前、免疫后7 d、14 d頸靜脈采血分離血清用于抗體水平測(cè)定。

1.2.3 免疫抗體持續(xù)期檢測(cè) 選取基礎(chǔ)抗體為零的33只5月齡同群羊，其中試驗(yàn)組28只免疫過(guò)小反芻獸疫弱毒苗，對(duì)照組5只羊不免疫，分別在第0、2、15、28、41、54、67周采血抗體檢測(cè)，頸靜脈采集全血，分離的血清按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128稀釋后進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)，試驗(yàn)操作按阻斷ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 母源抗體的檢測(cè) 母羊免疫抗體陽(yáng)性，6個(gè)月后陸續(xù)生產(chǎn)，觀察其生產(chǎn)性能、羔羊生長(zhǎng)發(fā)育和成活率。選取生產(chǎn)相差1 d～2 d的母羊單獨(dú)飼養(yǎng)在一起，羔羊22只，于30、44、58、72、88日齡采血，應(yīng)用阻斷ELISA試劑盒測(cè)定其母源抗體水平。

1.2.5 不同檢測(cè)方法的比較 使用市面上出售的間接ELISA、阻斷ELISA、抗體檢測(cè)金標(biāo)試紙卡按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，比較分析不同方法的檢測(cè)結(jié)果，選出適合本單位使用的抗體檢測(cè)方法。

2 結(jié)果2.1 免疫羊臨床安全性觀察

免疫母羊在免疫后15 d內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何局部或全身不良反應(yīng)，母羊生產(chǎn)的羔羊也未發(fā)現(xiàn)弱羔、發(fā)育不全、成活率低等狀況，證明PPR疫苗臨床應(yīng)用較安全。

2.2 不同免疫方法的抗體檢測(cè)

60只發(fā)育成熟且配有耳標(biāo)的母羊，小反芻獸疫基礎(chǔ)抗體為陰性，分別在免疫前(0 d)、免疫后7 d、14 d測(cè)免疫抗體，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同劑量或不同免疫方法的免疫檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組4只羊在未免疫后7 d、14 d后體內(nèi)PPRV抗體全部陰性，排除試驗(yàn)組自然感染的可能。試驗(yàn)組疫苗免疫后7 d有抗體產(chǎn)生，PB平均值67.93±17.25，14 d后抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%，PB平均值83.83±10.03，說(shuō)明免疫接種14 d后產(chǎn)生的免疫抗體水平較高；皮下1倍劑量注射、肌肉注射，14 d后都能產(chǎn)生較高水平的免疫抗體，說(shuō)明皮下、肌肉注射都比較安全，且都能產(chǎn)生高水平的抗體；皮下1倍劑量注射、2倍劑量注射后，結(jié)果經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，免疫抗體水平的差異不顯著(P>0.05)，1倍劑量免疫后效果較好，無(wú)需加大劑量，說(shuō)明1倍劑量中含有的病毒量足以刺激機(jī)體產(chǎn)生合格免疫抗體。

2.3 免疫抗體持續(xù)期檢測(cè)

對(duì)基礎(chǔ)抗體為陰性的33只5月齡同群羊分別在第0、2、15、28、41、54、67周采血，分離血清檢測(cè)抗體水平,利用每組抗體滴度的幾何平均數(shù)來(lái)表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均抗體滴度，制作PPRV免疫抗體消長(zhǎng)折線圖(圖1)。

對(duì)照組5只羊(耳標(biāo)號(hào)0821、0813、0815、0817、0820)，免疫組28只羊中有1只淘汰(耳標(biāo)號(hào)4196)，實(shí)際檢測(cè)32只羊的免疫抗體，對(duì)照組羊抗體始終為陰性，試驗(yàn)組羊免疫2周后抗體水平達(dá)到峰值，免疫抗體合格率達(dá)到100%；第15、28、41、54、67周，免疫組抗體滴度的離散度較大，平均抗體滴度隨時(shí)間推移持續(xù)下降，但抗體合格率到免疫后67周一直保持在100%。

圖1 PPRV免疫抗體消長(zhǎng)情況

2.4 母源抗體的檢測(cè)

對(duì)22只羔羊分別在30、44、58、72、88日齡進(jìn)行母源抗體檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 母源抗體檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，羔羊在58日齡以內(nèi)母源抗體水平較高，羔羊能獲得較好的保護(hù)，避免PPRV的早期感染，隨著日齡的增加羔羊母源抗體水平下降，尤其在72日齡左右抗體水平下降比較顯著，因此可以在羔羊72 d左右時(shí)進(jìn)行免疫接種。羔羊88日齡時(shí)，母源抗體已趨于消失，選擇在90 d～100 d羔羊斷奶[4]時(shí)再免疫，擔(dān)心存在羔羊抵擋不了外界PPRV的侵染，因此首免具體時(shí)間應(yīng)根據(jù)羔羊母源抗體水平來(lái)決定。

2.5 不同檢測(cè)方法的比較

隨機(jī)選取免疫后的63份羊血清分別用阻斷ELISA、間接ELISA及抗體檢測(cè)金標(biāo)卡的方法測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。間接ELISA檢出的陽(yáng)性率最高，阻斷ELISA此之，膠體金卡檢出的陽(yáng)性率最低。

表3 不同檢測(cè)方法比較結(jié)果

3 討論

對(duì)榆林地區(qū)的各縣區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)及養(yǎng)殖戶進(jìn)行小反芻獸疫疫苗臨床應(yīng)用調(diào)查結(jié)果表明，未發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)，母羊繁殖性能未受影響，對(duì)疫情危險(xiǎn)區(qū)接種疫苗后，疫情得到了有效控制，未見(jiàn)免疫接種后的羊群再次發(fā)生該病，安全性試驗(yàn)結(jié)果與印春生等[5]和楊鮮銀[6]報(bào)道的一致，表明該疫苗對(duì)陜北白絨山羊安全性良好。按照說(shuō)明書(shū)劑量皮下1倍劑量、2倍劑量或肌肉注射接種后，結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，免疫抗體水平的差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明含有的病毒量足以刺激機(jī)體產(chǎn)生合格免疫抗體，非特殊情況下不必加大使用劑量。免疫后7 d已經(jīng)開(kāi)始產(chǎn)生抗體，14 d后抗體合格率上升為100%，抗體水平達(dá)到峰值，這與徐雅萍[7]報(bào)道的一致，表明該疫苗具有很好的免疫效果。

繁殖母羊群已進(jìn)行過(guò)PPR疫苗接種，抗體陽(yáng)性，出生的羔羊母源抗體在72日齡內(nèi)維持在較高水平，羔羊能獲得較好的保護(hù)，避免PPRV的早期感染，隨著日齡的增加，羔羊母源抗體水平降低，88日齡抗體下降趨勢(shì)最為顯著。在實(shí)際生產(chǎn)中，羔羊的首次免疫應(yīng)根據(jù)母源抗體消長(zhǎng)來(lái)確定，一方面這種母源抗體除有抗PPRV感染、起到被動(dòng)免疫作用外，在一定條件下會(huì)不同程度地干擾弱毒苗接種和抑制主動(dòng)免疫抗體的產(chǎn)生；另一方面，免疫過(guò)晚易造成免疫空擋?？紤]到目前母羊免疫工作確實(shí)到位，根據(jù)本研究中羔羊母源抗體消長(zhǎng)規(guī)律，羔羊72日齡左右時(shí)進(jìn)行免疫接種，既減少了母源抗體的影響，又避免了免疫空檔期[8-9]。榆林市作為PPR免疫地區(qū)，每年春、秋兩季對(duì)未免疫的新生羔羊進(jìn)行補(bǔ)免，而本地的產(chǎn)羔高峰期在當(dāng)年12月至次年2月，春季防疫一般在3月開(kāi)始，散養(yǎng)戶可以在春季防疫時(shí)免疫新生羔羊，規(guī)模場(chǎng)首免具體時(shí)間應(yīng)根據(jù)監(jiān)測(cè)羔羊母源抗體水平?jīng)Q定。

抗體檢測(cè)是了解免疫效果不可缺少的手段，而檢測(cè)方法的不同往往導(dǎo)致結(jié)果存在一定的差異，在本研究中，應(yīng)用阻斷ELISA、間接ELISA和膠體金卡3種方法對(duì)羊血清進(jìn)行小反芻獸疫免疫抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，3種檢測(cè)方法的抗體陽(yáng)性率有顯著差異，膠體金抗體陽(yáng)性率較低，間接ELISA抗體陽(yáng)性率較高。分析主要原因可能是膠體金抗原成分與被檢抗體的親和性，也與檢測(cè)的合格率直接相關(guān)，因此小反芻獸疫抗體膠體金只能作為早期診斷基礎(chǔ)和適時(shí)免疫參考，不能應(yīng)用到規(guī)模場(chǎng)免疫抗體水平檢測(cè)中，僅適合基層養(yǎng)殖場(chǎng)免疫抗體粗略評(píng)估。ELISA檢測(cè)技術(shù)較成熟，具有很高的特異性和敏感性[10]，適用于反芻動(dòng)物免疫抗體水平考核評(píng)估。應(yīng)用阻斷ELISA對(duì)基礎(chǔ)抗體為陰性的陜北白絨山羊進(jìn)行免疫抗體持續(xù)期檢測(cè)，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，表明新疆天康畜牧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的小反芻獸疫弱毒疫苗的免疫抗體維持期至少可以達(dá)到67周。