中田大山楂提取物對(duì)肝臟脂肪變性的保護(hù)作用分析

胡海杰，董青青，王秋彤，潘立文，張同存，羅學(xué)剛

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 賀州學(xué)院，賀州 542800)

近年來，人類高血脂的發(fā)生率呈明顯上升的趨勢(shì)[1]．高血脂能夠誘發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病和脂肪肝等，對(duì)人體健康危害極大．因此，預(yù)防和治療高血脂具有十分重要的臨床意義．山楂(Crataegus pinnatifida)是薔薇科植物，自古藥食兩用，具有健脾開胃、消食化滯等功效．現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，山楂具有預(yù)防和治療高血脂的作用[2–5]．在我國(guó)，山楂可以簡(jiǎn)單地劃分為兩大類，即分布于華北地區(qū)的北山楂(俗稱山里紅)和分布于江浙、云貴、兩廣等地區(qū)的南山楂．目前，《中國(guó)藥典》中所列山楂主要是北山楂品種，包括 Crataegus pinnatifida和 Crataegus pinnatifida var．Major這兩類．近年來，隨著人們對(duì)山楂越來越多的關(guān)注，新品種山楂也隨之誕生，這些新品種山楂是否也具有與傳統(tǒng)山楂相近的功效，尚有待研究確證．其中，中田大山楂是賀州學(xué)院潘中田教授從南方野生山楂(Crataegus cuneata)中挑選、嫁接培育而出的一種南山楂新品種，具有果大、豐產(chǎn)、抗逆能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[6]．前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)中田大山楂也具有較好地降低高脂小鼠血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等血脂指標(biāo)的功效，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)膽固醇的降低作用主要是通過阻斷 NF-κB核因子信號(hào)通路以抑制膽固醇合成限速酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而發(fā)揮的[7]，然而其對(duì)脂肪酸代謝以及肝臟脂肪變性的影響作用尚未闡明．因此，本文利用前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所采集留存的組織樣本，通過病理切片、RT-PCR分析中田大山楂提取物對(duì)肝臟的保護(hù)作用及降血脂機(jī)理．此外，利用體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞優(yōu)化建立了高脂細(xì)胞模型，并利用該模型進(jìn)一步對(duì)中田大山楂提取物的直接作用進(jìn)行了分析驗(yàn)證．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞 HepG2細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保藏，在DMEM/HG培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為 10%,的胎牛血清，于37,℃、5%, CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)．

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004)．

1.1.3 原料與試劑

中田大山楂為賀州學(xué)院潘立文教授惠贈(zèng)，由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過索氏提取法制備獲得提取物. DMEM/HG培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、Trizol裂解液，上海英俊生物技術(shù)有限公司；隨機(jī)引物，上海生工生物工程有限公司；dNTP、T4,DNA 連接酶、油酸、DMSO、異丙醇，Solarbio公司．

1.2 方法

1.2.1 中田大山楂主要成分的分析

中田大山楂的主要成分由廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心根據(jù)國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析測(cè)定．

1.2.2 中田大山楂提取物的制備

本實(shí)驗(yàn)使用乙醇進(jìn)行索氏提取法制備獲得提取物：取新鮮山楂果，洗凈、去核、切片(1～2,mm)，60,℃烘烤 24,h，粉碎過 80目篩，得山楂粉．山楂粉中加入 10倍量(g∶mL)的 95%,乙醇，提取 3次，每次 2.5,h，過濾，合并濾液．濾液 65,℃減壓蒸餾，得稀浸膏．加水至浸膏體積的兩倍，混勻，4,℃靜置 8,h，傾出上清液，沉淀部分過濾，棄掉濾液．取一定量的沉淀，加入 95%,的乙醇溶解，堿液調(diào)節(jié) pH 8～9，產(chǎn)生大量沉淀，過濾，棄濾餅．取堿沉后的濾液，加入一定量的活性炭，回流30,min，放冷，過濾．取脫色后的濾液調(diào)節(jié) pH 5～6，回收乙醇至盡，加入適量的水，4,℃靜置 4,h，過濾，沉淀于 40,℃減壓干燥，即得提取物．

1.2.3 高脂動(dòng)物模型的建立

健康雄性昆明小鼠 60只，4周齡，(20±2)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)5,d后，隨機(jī)分為6組，每組10只，具體分組及飼喂方式見表 1．其中高脂飼料配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為：基礎(chǔ)飼料(市售常規(guī)小鼠飼料)78.8%,，蛋黃粉10%,，豬油 10%,，膽固醇 1%,，脫氧膽酸鹽 0.2%,．

飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，濕度 50%,～60%,，自由飲水、進(jìn)食，其中受試樣品中田大山楂低、中、高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照辛伐他汀組每日灌胃給予相應(yīng)藥物，基礎(chǔ)組和高脂對(duì)照組則每日給予等體積的PBS．每 2～3,d更換 1次墊料，每日自然光照，實(shí)驗(yàn)持續(xù)5周．

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)方式Tab. 1 Experimental grouping and feeding mode

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

利用Trizol提取法將從小鼠肝臟提取的RNA用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄[8]．RNA 2,μg、隨機(jī)引物 5,μL，70,℃水浴 5,min，迅速冰?。?0,mol/L dNTPs 5,μL 、 5× buffer 5,μL 、RNAse 抑 制 劑0.625,μL、M-MLVRT 1,μL 混勻，37,℃反應(yīng) 1,h；70,℃保持10,min終止反應(yīng)．

取 1,μL 產(chǎn)物進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，以 GAPDH 作為內(nèi)對(duì)照，擴(kuò)增體系為 25,μL：雙蒸水 16.5,μL，10,mmol/L dNTP 2,μL，上、下游引物各 1,μL，100,μmol/L 10×PCR 緩沖液 2.5,μL，模板和酶各1,μL．PCR 條件：95,℃預(yù)變性 5,min；95,℃變性 30,s，共 28 個(gè)循環(huán)；54,℃退火 30,s，72,℃延伸 45,s；72,℃延伸10,min．引物序列見表2．

表2 RT-RCR引物序列Tab. 2 Primer sequence for RT-PCR

1.2.5 肝臟病理切片分析

將肝臟組織塊投入 10%,福爾馬林固定液中，再由體積分?jǐn)?shù) 10%,～100%,乙醇作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水分．將組織塊置于透明劑二甲苯中，再置于已熔化的石蠟中，最后放入熔蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋．在切片機(jī)上切成很薄的切片，組織切片進(jìn)行HE染色分析[9]．

1.2.6 高脂肝細(xì)胞模型的優(yōu)化建立

以不加油酸的 HepG2細(xì)胞作為空白對(duì)照(Control)．用 1、2、3、4、5 μg/mL 的油酸對(duì) HepG2 細(xì)胞誘導(dǎo) 48 h，5%,多聚甲醛固定 30 min，75%,乙醇洗滌 2次；油紅染色 30 min，75%,乙醇洗滌 2次；置于65,℃烘箱 10 min后，用 100%,異丙醇溶解油紅染色的細(xì)胞，在 600 nm 處測(cè)定吸光度，篩選出油酸最佳誘導(dǎo)質(zhì)量濃度．此外，以最佳質(zhì)量濃度的油酸分別對(duì)HepG2 細(xì)胞誘導(dǎo) 4、8、12、24、36、48、54 h，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間．

1.2.7 中田大山楂提取物對(duì)高脂細(xì)胞內(nèi)油脂形成的影響作用分析

在確定了高脂肝細(xì)胞模型建立方法之后，進(jìn)一步以 10、30、60 μg/mL 的中田大山楂提取物處理高脂細(xì)胞，通過油紅染色分析確定中田大山楂提取物對(duì)細(xì)胞內(nèi)油脂含量的影響作用．

2 結(jié)果與分析

2.1 中田大山楂主要成分分析

對(duì)中田大山楂的主成分進(jìn)行了分析檢測(cè)，結(jié)果見表 3．由表 3可知，中田大山楂含有豐富的維生素、氨基酸、微量元素、熊果酸、山楂酸、三萜類及黃酮類等活性物質(zhì)．

表3 中田大山楂主要成分Tab. 3 Main components of Zhongtian hawthorn

2.2 中田大山楂提取物對(duì)高脂小鼠脂肪代謝關(guān)鍵酶的調(diào)控作用分析

脂肪細(xì)胞是機(jī)體合成及儲(chǔ)存脂肪的倉(cāng)庫(kù)．當(dāng)長(zhǎng)期食用高熱量、高膽固醇食品時(shí)會(huì)引起肥胖，甚至造成肝臟病變[10–12]．脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(fatty acid transport protein，F(xiàn)ATP)是協(xié)調(diào)游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)攝取、攜帶脂肪酸跨越細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵基因，激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACAC)則分別是脂肪分解和合成的限速酶[13-14]．

為了探索中田大山楂對(duì)脂肪代謝過程的調(diào)控機(jī)制，利用 RT-PCR與 qRT-PCR方法對(duì)飼喂中田大山楂提取物的高脂小鼠脂肪組織中 FATP、HSL、ACAC等的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖 1所示．由圖 1可知，與正常對(duì)照組相比，高血脂組小鼠脂肪中FATP與ACAC均呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)，陽(yáng)性對(duì)照降血脂藥物辛伐他汀可抑制FATP與ACAC的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，中田大山楂提取物可以明顯上調(diào) FATP、下調(diào) ACAC的表達(dá)．而對(duì)于HSL，與模型對(duì)照組相比，中田大山楂提取物各劑量組均體現(xiàn)出明顯的上調(diào)作用，其中高劑量組(130,mg/(kg·d))尤為突出，可使HSL 上調(diào)約1.6倍．這些結(jié)果說明中田大山楂可以通過抑制ACAC的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而阻礙脂肪的生物合成．

圖1 中田大山楂提取物對(duì)高血脂小鼠脂肪代謝關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 1 Effect of Zhongtian hawthorn extract on the transcription level of key genes associated with lipometabolism in hyperlipidemia mice

2.3 中田大山楂提取物對(duì)高血脂小鼠肝臟脂肪變性的保護(hù)作用

肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的器官，并在身體里面起著去氧化，儲(chǔ)存肝糖，分泌性蛋白質(zhì)合成、產(chǎn)生膽汁等作用，而長(zhǎng)期的高脂飲食則會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性(即脂肪肝)，并逐漸演進(jìn)為肝纖維化等癥狀[15–17]．本課題組在前期小鼠血脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)[7]，中田大山楂提取物在給藥劑量為 50、90、130 mg/(kg·d)時(shí)可劑量依賴性地降低高脂小鼠血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等血脂指標(biāo)并抑制肥胖，然而其對(duì)肝臟脂肪變性的影響尚未確定．因此，在前期工作基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步通過免疫組化對(duì)中田大山楂給予后高脂小鼠肝臟組織形態(tài)的變化情況進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖 2所示．與基礎(chǔ)飼料的正常對(duì)照組小鼠相比，高脂組小鼠的肝臟細(xì)胞形態(tài)紊亂，低劑量的中田大山楂提取物對(duì)小鼠肝臟保護(hù)作用不明顯，而中、高劑量則可與顯著緩解高脂飼喂所引起的小鼠肝臟病變．

圖2 中田大山楂提取物對(duì)高血脂小鼠肝臟脂肪變性的保護(hù)作用Fig. 2 Protective effect of Zhongtian hawthorn extract on the hepatic steatosis in hyperlipidemia mice

2.4 中田大山楂提取物對(duì)高脂肝細(xì)胞的直接影響作用分析

通過上述研究發(fā)現(xiàn)，中田大山楂提取物可抑制體內(nèi)脂肪酸生物合成并對(duì)高血脂小鼠的肝臟病變具有很好的保護(hù)作用．但這種功效究竟是直接作用于肝細(xì)胞產(chǎn)生，還是在體內(nèi)吸收、分布、代謝等一系列過程中間接產(chǎn)生的作用？為了明確這一點(diǎn)并進(jìn)一步驗(yàn)證中田大山楂提取物對(duì)肝細(xì)胞脂肪代謝及高脂化的保護(hù)作用，利用體外培養(yǎng)的 HepG2肝細(xì)胞構(gòu)建了高脂細(xì)胞模型，并對(duì)其功能進(jìn)行了分析驗(yàn)證．

2.4.1 高脂肝細(xì)胞模型建立條件優(yōu)化

首先，對(duì)油酸誘導(dǎo)高脂細(xì)胞模型的最佳條件進(jìn)行了優(yōu)化．用 1、2、3、4、5 μg/mL 油酸對(duì) HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)48 h后，經(jīng)油紅染色后通過測(cè)定600 nm處的吸光度對(duì)細(xì)胞內(nèi)油脂含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖 3(a)所示，在采用 4 μg/mL油酸處理后，HepG2細(xì)胞內(nèi)油脂含量達(dá)到最大．采用4 μg/mL油酸對(duì)HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)最佳時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖 3(b)所示，誘導(dǎo) 48 h效果后高脂模型的建立效果為最佳．

圖3 高脂肝細(xì)胞模型的建立條件優(yōu)化Fig. 3 Optimization of the established high fat liver cell model

考慮到測(cè)定吸光度的方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)油脂的分析特異性及靈敏度均有所不足．進(jìn)一步通過油紅染色方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)的脂肪情況進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4所示．4 μg/mL油酸誘導(dǎo)48 h后(HF)，顯微鏡下觀察顯示 HepG2細(xì)胞中的油脂含量(圖中著色區(qū)域)顯著上升．而再次將油紅染色細(xì)胞用 100%,異丙醇溶解并測(cè)定600 nm處吸光度后，結(jié)果也顯示與對(duì)照組相比高脂誘導(dǎo)細(xì)胞中的油脂含量確有顯著增強(qiáng)(圖 4(b))，表明體外高脂肝細(xì)胞模型構(gòu)建成功．

2.4.2 中田大山楂提取物對(duì)高脂肝細(xì)胞內(nèi)油脂含量的影響

分別用 10,μg/mL(ZTL)、30,μg/mL(ZTM)、60μg/mL(ZTH)的中田大山楂提取物處理 HepG2高脂細(xì)胞，利用油紅染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)油脂含量變化情況，結(jié)果如圖 5所示．隨著中田大山楂提取物劑量的增加，HepG2高脂細(xì)胞內(nèi)油脂含量顯著降低，表明中田大山楂提取物能夠劑量依賴性地抑制肝細(xì)胞脂肪合成過程．

圖4 高脂肝細(xì)胞模型中油脂含量的變化Fig. 4 Changes of the fat content in high-fat liver cell model

圖5 中田大山楂提取物對(duì)高脂肝細(xì)胞內(nèi)油脂含量的影響Fig. 5 Effect of Zhongtian hawthorn extract on the fat content in high-fat liver cells

3 結(jié) 語(yǔ)

本文首先在動(dòng)物水平上明確了中、高劑量中田大山楂提取物(90,mg/(kg·d)、130,mg/(kg·d))對(duì)高血脂小鼠體內(nèi)脂肪生物合成的抑制作用以及對(duì)肝臟病變的保護(hù)作用．之后，建立并優(yōu)化了高脂肝細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平上通過油紅染色證實(shí)了60,μg/mL中田大山楂提取物可抑制肝細(xì)胞脂肪合成過程，為其相關(guān)功能食品及藥品的開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)．此外，本文所優(yōu)化確定的高脂肝細(xì)胞模型建立條件，對(duì)于降血脂活性物質(zhì)的高通量篩選與評(píng)價(jià)也具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值．