宮頸細胞DNA倍體異常伴ASCUS病變的臨床病理學意義

紀捷，張靜敏，程雪，李華，伍鳳平

（1南京市婦幼保健院病理科，南京210004；2武漢蘭丁云醫(yī)學檢驗實驗室，武漢430206）

宮頸癌是由高危型HPV持續(xù)感染所致。HPV將其DNA片段整合到宮頸細胞核內(nèi)DNA上，可引起染色體數(shù)量改變形成非整倍體細胞[1-3]。非整倍體細胞早期沒有形態(tài)上的改變，隨著病變發(fā)展，逐漸演變成宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），最終導致宮頸癌[4-6]。宮頸細胞學按Bethsda報告系統(tǒng)（The Bethesda System, TBS）為診斷標準。具體分為正常、意義未明的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cells of undermined significance，ASCUS）、非典型鱗狀細胞不除外高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（atypical squamous cells, cannot exclude highgrade squamous intraepithelial lesion, ASC-H）、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL）和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL），病理診斷分為：慢性炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤變1級（CIN1）、CIN2、CIN3和宮頸癌。其中，LSIL相當于CIN1，HSIL相當于CIN2、CIN3和癌。

宮頸細胞DNA定量分析主要測定宮頸細胞DNA倍體是否異常，CIN或?qū)m頸癌中宮頸細胞多有DNA非整倍體改變[7-9]。本文試圖通過研究ASCUS伴有DNA倍體異常的患者的病理改變，判別宮頸癌及癌前病變嚴重程度及發(fā)展趨勢。

資料與方法

1 標本來源

2016年10月至2017年7月，對南京市婦幼保健院33188名婦女，年齡范圍為21～73歲，平均年齡（41±8）歲，行宮頸細胞學檢查，按常規(guī)方法進行宮頸細胞學取材。采用于液基薄層制片，試劑盒由武漢蘭丁醫(yī)學高科技有限公司提供。每個樣本制成二張液基薄層玻片，一張用巴氏染料染色供常規(guī)細胞學診斷，另一張用Feulgen染料染色供DNA倍體測定。

2 常規(guī)細胞學診斷

常規(guī)細胞學診斷標準按TBS診斷系統(tǒng)進行，診斷分別為正常、ASCUS、ASC-H、LSIL和HSIL。

3 DNA圖像分析儀行DNA倍體分析

所有Feulgen染色片采用蘭丁全自動細胞圖像分析系統(tǒng)進行掃描處理（武漢蘭丁醫(yī)學高科技有限公司），其符合歐洲定量細胞病理學會DNA定量分析圖像系統(tǒng)的各項標準[10]。診斷標準及操作過程按標準程序進行[11]。該系統(tǒng)對每張玻片上1000個以上的細胞核進行掃描測定。經(jīng)掃描后的每個細胞核均有500個特征值，其中包括形態(tài)特征、吸光特征、具體結(jié)構(gòu)特征、Markovian和非Markovian結(jié)構(gòu)特征和長度特征等。系統(tǒng)根據(jù)不同細胞成分所具有的不同特征參數(shù)來完成自動細胞分類和計數(shù)過程。標準對照細胞為同張玻片上的100個正常上皮細胞，所測出的積和光密度（integrated optical density, IOD）為2c的參考值，其變異系數(shù)（coefficient of variation,CV）值小于5%。凡是有＞5c以上非整倍體細胞的玻片，均由細胞技術(shù)員在顯微鏡下逐一對大于5c細胞進行核實，以排除該系統(tǒng)將垃圾和重疊的細胞核誤認為異常細胞。凡發(fā)現(xiàn)3個或3個以上大于5c的異倍體細胞或發(fā)現(xiàn)異倍體峰，即診斷為陽性，其余診斷為陰性。

4 陰道鏡及病理學檢查

宮頸常規(guī)細胞學診斷ASCUS及以上級別者或DNA定量分析異常者，行陰道鏡的檢查并對宮頸可疑部位進行4個點以上的組織活檢，其中76例細胞學和DNA倍體診斷為正常，而陰道鏡下診斷為可疑，從而行組織學活檢。每例活檢樣本由有經(jīng)驗的病理學醫(yī)生出病理診斷報告。病理診斷報告分為正常、宮頸炎、CIN1、CIN2、CIN3或原位癌及浸潤癌。

5 統(tǒng)計學處理

常規(guī)細胞學診斷分為正常、ASCUS、ASC-H、LSIL和HSIL 5個級別。將每個級別分成2組，即DNA倍體正常和異常2組。比較不同級別2組之間在診斷CIN2、CIN3和宮頸浸潤癌例數(shù)的百分比的不同。采用配對χ2比較，運用SPSS 13.0軟件進行處理，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 539例宮頸病理活檢情況

539位婦女進行宮頸組織學活檢?；顧z組織病理學診斷為372例宮頸炎、145例CIN1、71例CIN2、46例CIN3和5例浸潤癌。在539例活檢病例中，常規(guī)細胞診斷為173例正常，251例ASCUS，30例ASC-H，48例LSIL和37例HSIL。DNA倍體分析發(fā)現(xiàn)539例中，DNA倍體異常278例，正常為261例。

2 ASCUS病例伴有DNA倍體異常者患CIN2及CIN2以上級別病例數(shù)增多

在常規(guī)細胞診斷為ASCUS的251例宮頸樣本中，無非整倍體細胞168例中發(fā)現(xiàn)8例CIN2的病變（4.7%），而有非整倍體細胞的83例中發(fā)現(xiàn)17例CIN2或CIN2以上級別的病變（20.5%），這二組的百分比之間用配對χ2檢驗（χ2=6.69，P=0.023），有顯著性差異。常規(guī)細胞學診斷30例ASC-H中，9例無非整倍體細胞中有2例病理診斷為CIN2（22%），而21例伴有非整倍體細胞病例中有19例為CIN2或CIN2以上級別的改變（90.4%），二組之間配對χ2檢驗有顯著性差異（χ2=11.41，P=0.009）。在48例常規(guī)細胞學診斷為LSIL病例中，8例無非整倍體細胞中僅有2例為CIN2病變（25%），而40例有非整倍體細胞中有20例CIN2或CIN2以上級別病變（50%），二組之間配對χ2檢驗無顯著性差異（χ2=0.365，P=1之間）。在37例常規(guī)細胞診斷為HSIL病例中均伴有非整倍體細胞，其中31例病理診斷為CIN2或CIN2以上級別的病變（83.7%）（表1）。圖1-圖3顯示一例宮頸細胞診斷為ASCUS伴有DNA倍體異常，組織病理診斷為CIN2。在111例CIN2或CIN2以上級別病例中，有96例（86.5%）宮頸細胞發(fā)現(xiàn)非整倍體，15例（13.5%）宮頸細胞內(nèi)無非整倍體（表1）。

表1 539例宮頸活檢病例常規(guī)細胞學各級診斷中整倍體組與非整倍體組之間的差別Tab. 1 Difference between diploid and aneuploid groups in 539 cervical biopsies

圖1 宮頸細胞常規(guī)診斷為ASCUS。比例尺，25μmFig.1 ASCUS diagnosed by conventional cytology. Scale bar, 25μm

圖2 DNA倍體診斷發(fā)現(xiàn)大量＞5c的的異倍體細胞Fig. 2 DNA ploidy diagnosis detected aneuploid cells (＞5c)

圖3 宮頸組織活檢病理組織診斷為CIN2。比例尺，100μmFig. 3 Cervical tissue biopsy and pathological diagnosis of CIN2. Scale bar, 100μm

討 論

1 ASCUS病例伴有DNA倍體異常者發(fā)展為CIN2或CIN2以上級別的風險較大

在宮頸TBS診斷系統(tǒng)中，?？梢夾SCUS病例，ASCUS病例如何處理是臨床上常見的問題。目前，臨床上如發(fā)現(xiàn)ASCUS病例，常要求做HPV-DNA病毒測定。如果高危型HPV病毒檢測陽性，說明有HPV病毒存在，病變有潛在發(fā)展趨勢，要求患者進一步做陰道鏡和組織活檢；如果高危型HPV病毒陰性，則不需要進一步處理。

本研究ASCUS或ASC-H病例伴有宮頸細胞非整倍體病例中，活檢證實分別有20%和90%病例為CIN2或CIN2以上級別的病變；而沒有非整倍體細胞者，分別只有4.7%和22%病例為CIN2或CIN2以上級別的病變。有報道證實，無非整倍體細胞的ASCUS、LSIL患者的陰性預測值為95%，而具有非整倍體細胞的ASCUS、LSIL患者2個月后發(fā)展為CIN3或?qū)m頸癌的陽性預測值為46%，而3年后100%發(fā)展為宮頸癌，其陽性預測值為100%[10]。因此建議，ASCUS無非整倍體細胞者，可進行定期隨訪，無需活檢，而ASCUS伴有非整倍體者要求活檢。ASC-H病例伴有非整倍體細胞者病變較無非整倍體細胞者嚴重。這些結(jié)果均表示DNA倍體分析結(jié)合TBS診斷可用于判別病變的嚴重程度和發(fā)展趨勢。

2 細胞學診斷為ASC-H、LSIL、HSIL病例或病理診斷為CIN2或以上病例多伴有DNA倍體異常

DNA倍體分析用于宮頸細胞檢查已在國內(nèi)外均有報道。在細胞學診斷為ASC-H、LSIL、HSIL和病理診斷為CIN2或CIN2以上患者，宮頸細胞多有DNA非整倍體。本研究的結(jié)果與這些報道一致[10,11]，即在TBS診斷為ASC-H、LSIL或HSIL病例分別有90.4%、50%和83.7%的病例細胞中有DNA倍體異常，在111例病理活檢證實為CIN2、CIN3或浸潤癌病例中有15例（13.5%）無非整倍體細胞，96例（86.5%）均可見非整倍體宮頸細胞。為什么宮頸癌或?qū)m頸癌前病變的宮頸細胞核內(nèi)DNA倍體會改變呢？HPV病毒感染可通過病毒E6或E7蛋白影響pRb或p53通道，而引起被感染細胞核內(nèi)染色體倍體改變，最終可致宮頸癌前病變和浸潤癌。這些均表明HPV病毒可引起宮頸細胞核內(nèi)染色體倍體異常。

總之，DNA倍體異常是細胞內(nèi)腫瘤改變的重要標記之一。ASCUS病例伴有DNA倍體異常者，發(fā)生CIN2或CIN2以上級別的可能性高。