黑熊皮膚橫梗霉菌株的分離和鑒定

曾雪花高旭龍王吟方亭劉玉清趙阿勇何珂

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，臨安，311300；2.浙江省長(zhǎng)興太湖龍之夢(mèng)動(dòng)物世界文化旅游開(kāi)發(fā)有限公司，長(zhǎng)興，313100)

毛霉菌病是繼念珠菌病和曲霉菌病之后，第三類(lèi)最常見(jiàn)的侵襲性真菌性疾病。當(dāng)機(jī)體免疫功能降低時(shí)毛霉菌(Mucorvarians)可直接侵入支氣管和肺，或經(jīng)血行及淋巴管播散侵入，其菌絲侵犯血管引起血栓形成和梗死，產(chǎn)生急性炎癥[1]。目前在人、豬、馬、羊、狗、貓、鳥(niǎo)類(lèi)、袋鼠和一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都有感染發(fā)病的報(bào)道[2-3]，但對(duì)于熊等大型哺乳動(dòng)物感染毛霉菌的情況還未見(jiàn)報(bào)道。2018年1月浙江長(zhǎng)興太湖龍之夢(mèng)動(dòng)物園的數(shù)只黑熊先后發(fā)生皮膚增厚、大面積脫毛現(xiàn)象。本文對(duì)患病個(gè)體所采集的病灶進(jìn)行病理學(xué)觀察，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)等序列分析，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，旨在為患病個(gè)體的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

浙江省長(zhǎng)興縣龍之夢(mèng)動(dòng)物園黑熊(Ursusthibetanus)患病處皮屑。將皮膚病灶及周?chē)凭竞?，用一次性滅菌刀片刮取皮屑，裝入滅菌EP管中，送實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)。

1.2 臨床癥狀

患病黑熊精神食欲正常，患處有癢感，常在墻壁和樹(shù)干上摩擦，導(dǎo)致皮膚增厚、大面積脫毛、有皮屑(圖1)。

圖1 患病的熊皮膚表面(A)和(B)及培養(yǎng)后得到的菌落圖(C)和(D)Fig.1(A)(B)the surface of sick bear and(C)(D)the colonies after cultivation

1.3 真菌分離培養(yǎng)

將皮屑加1 mL滅菌PBS吹打后，接種于SDA培養(yǎng)基上(蛋白胨10 g，瓊脂20 g，葡萄糖40 g，加蒸餾水定容至1 L，115℃高壓滅菌20 min，倒板備用)。于37℃培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)明顯菌落。

1.4 菌株抗藥敏試驗(yàn)

采用ROSCO紙片擴(kuò)散法，藥物包括5-氟胞嘧啶，兩性霉素B，氟康唑，伊曲康唑和酮康唑，均為成品藥敏片。另于藥店購(gòu)買(mǎi)達(dá)克寧硝酸咪康唑乳膏和曲安奈德益康唑乳膏，檢測(cè)硝酸咪康唑和硝酸益康唑?qū)τ谠撜婢欠窬哂幸种谱饔?。其中膏狀藥品自制藥敏片過(guò)程如下：取1 g藥膏溶解至10 mL水中，取1 mL配置好的藥液浸入已滅菌的含100片紙片的小瓶中，置冰箱內(nèi)1～2 h取出烘干，并置冰箱中保存?zhèn)溆?。?jì)算藥敏片濃度為20 μg/片硝酸咪康唑(達(dá)克寧硝酸咪康唑乳膏)和10 μg/片硝酸益康唑(曲安奈德益康唑乳膏)。

藥敏試驗(yàn)：用無(wú)菌棉簽將0.5麥?zhǔn)蠁挝痪壕鶆蛲坎加赟DA培養(yǎng)基上，待平板表面干后貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌環(huán)直徑(抑菌環(huán)邊緣少量菌落生長(zhǎng)忽略不計(jì))。藥敏紙片法參考標(biāo)準(zhǔn)敏感≥21 mm，耐藥≤10 mm(由Rosco公司提供參考標(biāo)準(zhǔn))。

1.5 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

收集菌體，采用乳酸棉酚藍(lán)染液染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 菌株分子生物學(xué)鑒定

在SDA平板上擴(kuò)培的真菌制成孢子懸液，采用將真菌通用引物擴(kuò)增(18S區(qū)段：NS3(5′-GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3′)和NS24(5′-AAACCTTGTTACGACTTTTA-3′)，28S區(qū)段：NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)，ITS區(qū)段：ITS1(5′-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系為30 μL，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析，片段大小符合目的的PCR產(chǎn)物送杭州鉑尚測(cè)序公司測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果在GenBank中通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)，以獲得相似度較高的序列，再與所測(cè)序列通過(guò)MegAlign進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以確定該菌株的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果

2.1 真菌分離培養(yǎng)

從患病的熊皮膚表面(圖1-A和B)共收集4份病料，其中只有2份在SDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出明顯的帶有菌絲的菌落，而其余2份僅出現(xiàn)疑似細(xì)菌的菌落。疑似為真菌的樣品所獲得的菌落形態(tài)相近(圖1-C和D)，因此隨機(jī)選擇一個(gè)進(jìn)行下面的試驗(yàn)。

2.2 抗藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明該真菌對(duì)伊曲康唑和兩性霉素B高度敏感；對(duì)酮康唑中度敏感；對(duì)氟康唑和氟胞嘧啶耐藥(表1)。而采用的2種膏狀藥物中，該真菌對(duì)達(dá)克寧硝酸咪康唑乳膏敏感，而對(duì)曲安奈德益康唑乳膏效果中介(表1)。

表1 采用的藥敏紙片濃度和抑菌效果

Tab.1 The concentration of drug paper and the antibacterial effect

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

該菌在SDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，在37℃培養(yǎng)48 h后可長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基(25 cm)，肉眼可見(jiàn)明顯的絲狀型菌落(圖1-C和D)。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)由許多菌絲體和分生孢子，孢囊梗分枝，頂端形成球形或近球形的孢子囊，孢子囊孢子多呈球形、有厚壁孢子(圖2)。根據(jù)在PDA培養(yǎng)基的生長(zhǎng)特點(diǎn)及鏡下形態(tài)學(xué)檢查，初步鑒定為毛霉科(Mucoraceae)真菌。

圖2 乳酸棉酚藍(lán)染液染色后光學(xué)顯微鏡下真菌形態(tài)。放大倍數(shù)分別為(A)10×10和(B)40×10Fig.2 The morphology of fungal under optical microscopeafter dying of lactophenol cotton blue.The magnification timesin A and B are 10×10 and 40×10，respectively

2.4 分子生物學(xué)鑒定

本研究選取18S區(qū)段、28S區(qū)段和ITS區(qū)段進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)NCBI Blast結(jié)果顯示，該菌推測(cè)為橫梗霉屬(Lichtheimia)或犁頭霉屬(Absidia)，采用ITS、28S和18S區(qū)段進(jìn)行系統(tǒng)樹(shù)分析，其中ITS分析過(guò)程中參與比對(duì)的序列如下：Lichtheimiaramosa(GenBank：HQ285700、FJ719386)，Lichtheimiaomata(GenBank：GQ342891)，Absidiacorymbifera(GenBank：AY944895、DQ118985和DQ118982)，Lichtheimiasphaerocystis(GenBank：GQ342900和GQ342899)，以Fennellomyceslinderi(GenBank：GQ249890)為外類(lèi)群。28S系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建過(guò)程中參與比對(duì)的序列如下：Lichtheimiaramosa(GenBank：GQ342953和GQ342940)，Absidiacorymbifera(GenBank：AF113445)，Absidiahyalospora(GenBank：EU826368)，Absidiablakesleeana(GenBank：AF157171)，Lichtheimiacorymbifera(GenBank：GQ342932、FJ719444和GQ342910)，以Paecilomyceslilacinus(GenBank：AY213717)為外類(lèi)群。18S系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建過(guò)程中參與比對(duì)的序列如下：Lichtheimiaramosa(GenBank：JQ004932)，Absidiacorymbifera(GenBank：AF113407)，Absidiablakesleeana(GenBank：AF157117)，Lichtheimiacorymbifera(GenBank：HM590658、KJ123705和HM590662)，以Dichotomocladiumrobustum(GenBank：JQ775466)為外類(lèi)群。

聚類(lèi)結(jié)果顯示，樣品中獲得的菌株(Strain)在28S和ITS分析結(jié)果中，和Lichtheimiaramosa聚集在一起，支持率分別為89%和100%，但在18S的分析結(jié)果中，和Lichtheimiacorymbifera聚類(lèi)在一起(圖3)。Lichtheimiacorymbifera和Lichtheimia在2009年被認(rèn)為認(rèn)為是傘枝橫梗霉的兩個(gè)種。

圖3 (A)28S、(B)ITS和(C)18S序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字代表為5000次時(shí)的支持率Fig.3 Phylogenetic tree of(A)28S，(B)ITS and(C)18S.The number on the node represents the supporting rate of 5000 times

3 討論

毛霉菌病是由于感染毛霉菌目而機(jī)會(huì)性感染形成，在人群中和其相關(guān)的重要的免疫抑制條件包括糖尿病、血液惡性腫瘤、移植受者使用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑和嚴(yán)重?zé)齻惹闆r[4]。由于免疫抑制劑使用的不斷增加，毛霉菌病變得越來(lái)越普遍，人類(lèi)患者出現(xiàn)較高死亡率，往往在50%以上[5]。較為常見(jiàn)的毛霉菌有根霉菌屬(Rhizopus)、毛霉菌屬和犁頭霉屬。根據(jù)生理學(xué)特征、系統(tǒng)發(fā)生和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)分析，認(rèn)為犁頭霉屬的傘狀犁頭霉(Absidiacorymbifera)、Absidiablakesleeana和Absidiahyalospora應(yīng)該被重新分類(lèi)為一個(gè)單獨(dú)的科Lichtheimiaceae fam.nov.。因此應(yīng)該訂正為L(zhǎng)ichtheimiacorymbifera，Lichtheimiablakesleeana和Lichtheimiahyalospora[6]。研究發(fā)現(xiàn)一些曾被報(bào)道為L(zhǎng)ichtheimiacorymbifera的案例，可能為橫梗霉(Lichtheimiaramosa)[7]。2012年，香港大學(xué)發(fā)現(xiàn)了新型的毛霉菌，命名為香港型橫梗霉菌(Lichtheimiahongkongensis)，嚴(yán)重更可致命[8]。

黑熊毛霉病目前尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)病料鏡檢及分離、純化培養(yǎng)，真菌形態(tài)學(xué)特征對(duì)病原真菌作出初步分類(lèi)鑒定。真菌的ITS序列具有高度的保守性，常作為真菌近似種及亞種的鑒別依據(jù)，通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行真菌ITS序列同源性比較并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。根據(jù)顯微鏡圖片中存在分叉的孢囊柄(圖2)，并且結(jié)合ITS和28S的結(jié)果(圖3-A和B)，推測(cè)該菌株為橫梗霉。盡管在聚類(lèi)分析結(jié)果中，18S的結(jié)果認(rèn)為待檢菌株和Lichtheimiacorymbifera較為接近，但I(xiàn)TS序列在鑒定菌種時(shí)比18S和β-action更加可靠，因此我們采用ITS和28S的分析結(jié)果。

推測(cè)認(rèn)為浙江北部山區(qū)空氣濕度較大，適合真菌類(lèi)病原體的生長(zhǎng)，再加上黑熊個(gè)體剛經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸，熊仔抗病能力差等因素，容易感染真菌，但目前個(gè)體精神狀態(tài)良好，飲食無(wú)明顯影響，因此建議采用外用抗真菌藥物治療。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該真菌對(duì)伊曲康唑和兩性霉素B高度敏感；對(duì)酮康唑中度敏感；對(duì)氟康唑和氟胞嘧啶耐藥。這提示我們?cè)谂R床治療皮膚真菌感染時(shí)，應(yīng)該充分考慮到病原的多樣性，及時(shí)進(jìn)行病原菌的分離及藥敏試驗(yàn)，針對(duì)性用藥。在試驗(yàn)中我們同樣也進(jìn)行了達(dá)克寧硝酸咪康唑乳膏和曲安奈德益康唑乳膏的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示前者為敏感，可以考慮用于治療。