用45個SNP位點組合對國家嚙齒類實驗動物種子中心3個封閉群小鼠群體的遺傳狀況分析*

李銀銀 王 洪 李長龍 郭 萌 魏 杰張 鈺 黃 韌 陳振文 杜小燕

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)(2.中國食品藥品檢定院實驗動物研究所，北京 100050)(3.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510633)

封閉群小鼠在生物醫(yī)學(xué)研究各個領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[1]。國家嚙齒類實驗動物種子中心負責(zé)對國內(nèi)各實驗動物生產(chǎn)單位提供種源，其動物遺傳質(zhì)量關(guān)系到國家實驗動物質(zhì)量安全，影響巨大。定期對群體遺傳質(zhì)量實施監(jiān)測可為維持群體符合封閉群要求提供可靠信息，為群體保種和繁殖方式提供指導(dǎo)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是近年來出現(xiàn)的第三代遺傳標(biāo)記，由于其具有數(shù)目多、分布廣、遍布整個基因組及穩(wěn)定遺傳的特點，適于對小鼠遺傳狀況進行描述[2]。但在國內(nèi)報道中，大多數(shù)研究者選用微衛(wèi)星DNA技術(shù)對封閉群小鼠進行遺傳質(zhì)量分析，而SNP則多用于近交系小鼠的遺傳檢測[2-4]。本實驗選取45個SNP位點對來自國家嚙齒類實驗動物種子中心北京分中心的ICR(BICR)和上海分中心的ICR(SICR)和KM(SKM)小鼠3個群體進行遺傳分析，以期探討單核苷酸多態(tài)性分析在封閉群小鼠遺傳質(zhì)量檢測中的應(yīng)用，并與我們前期完成的微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA or short tandem repeat, STR)和生化位點方法進行了比較。

1 材料與方法

1.1 動物樣本

選取國內(nèi)較常用的2個封閉群小鼠品系的3個群體，分別是來自國家嚙齒類實驗動物種子中心北京分中心的ICR群體(BICR)和上海分中心的ICR群體(SICR)及KM種群(SKM)，均為SPF級。每個群體隨機選擇30只小鼠，取0.1 g腎組織于無菌EP管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩１緦嶒炓呀?jīng)通過首都醫(yī)科大學(xué)動物實驗及實驗動物福利委員會審核(AEEI-2016-187)。

1.2 小鼠基因組DNA的制備

對EP管中的組織加入2 mL DNA裂解抽提緩沖液，20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，10 μL RNA酶，55 ℃消化過夜，酚氯仿法提取基因組DNA，加入TE緩沖液進行溶解。經(jīng)Nanodrop 2000c微量分光光度計檢測吸光度A值在1.8～2.0之間，并經(jīng)1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA質(zhì)檢合格。取原液適量稀釋為50～100ng/μL濃度作為DNA模板，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNP位點的選擇

本研究所用45個SNP位點從相關(guān)文獻中選取[3-5]，位點的選擇盡量均勻分布于小鼠的1～20號染色體上，較大范圍覆蓋小鼠基因組。

1.4 飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)技術(shù)SNP位點基因分型[6]

1.4.1PCR擴增反應(yīng)：根據(jù)SNP位點查詢NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列信息，使用Sequenom公司的引物設(shè)計軟件Assay design 3.1設(shè)計PCR反應(yīng)和單堿基擴展引物，并進行引物合成。PCR體系包括模板DNA1μL，上下游引物(500 nmol/L)各1 μL，dNTP Mix(25 mmol/L)0.1 μL，HotStarTaq DNA 聚合酶(5U/μL)0.1 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.325 μL，PCR Buffer(1.25×)0.625 μL和ddH2O 1.85 μL。擴增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)45次；最后72 ℃持續(xù)3 min。

1.4.2產(chǎn)物堿性磷酸酶處理反應(yīng)：反應(yīng)體系包括0.3 μL蝦堿性磷酸酶(SAP)(1 U/μL)，10×的SAP Buffer 0.17 μL和ddH2O 1.53 μL，將反應(yīng)混合物加入到上一步PCR產(chǎn)物中。設(shè)置反應(yīng)程序為：37 ℃保溫20 min，85 ℃保溫5 min。

1.4.3單堿基延伸反應(yīng)：將多重PCR反應(yīng)混合物加入上一步SAP酶消化后的產(chǎn)物中。iPLEX反應(yīng)體系為iPLEX酶0.041 μL，iPLEX Buffer Plus 0.2 μL，引物混合液0.94 μL，iPLEX終止混合液0.2 μL和ddH2O 0.619 μL。設(shè)置延伸反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s內(nèi)部循環(huán)5個，持續(xù)外部循環(huán)40個。最后72 ℃延伸3 min。

1.4.4MALDI-TOF-MS檢測：PCR反應(yīng)完成后向產(chǎn)物384孔板中加入16 μL三蒸水，翻轉(zhuǎn)離心機中室溫旋轉(zhuǎn)混勻30 min，經(jīng)樹脂純化。將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物點在樣品靶上，MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析，檢測結(jié)果使用TYPER4.0軟件獲取，根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本各位點基因分型。

1.5 群體遺傳分析

將所有樣本的每個SNP位點的基因型以AA、BB和AB等形式輸入Popgen 1.32軟件中分析[7]。利用該軟件計算不同個體在各SNP位點上的基因頻率、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均雜合度(Ha)及香隆信息指數(shù)等群體遺傳參數(shù)；利用PIC_CALC軟件計算各位點的多態(tài)性信息含量(PIC)。

2 結(jié)果

2.1 MALDI-TOF-MS檢測

采用MALDI-TOF-MS技術(shù)對3個小鼠封閉群共90個樣本進行45個位點的單核苷酸多態(tài)性等位基因分型，并計算了每個SNP位點在3個群體中的等位基因頻率(表1)。從表中可以看出，大多數(shù)SNP位點(27個)在3個群體中的基因頻率有所不同，但是有6個SNP位點(rs8271367、rs29492976、rs13466915、rs3089109、rs3023342和rs3091048)在3個群體中均為單態(tài)，有相同的等位基因型；有8個位點(rs29778277、rs32390670、rs3089984、rs3023381、rs3091174、rs3023436、rs3023442和rs3089349)在2個ICR群體中均為純合而且單態(tài)，而在KM群中則存在兩種等位基因型；相反有3個位點(rs13476538、rs29315008和rs3089205)在KM小鼠群體中呈單態(tài)而在ICR中呈現(xiàn)多態(tài)；另有1個SNP位點(rs3089604)在ICR和KM群中的等位基因型完全不同。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

封閉群SKM小鼠在45個SNP位點中，15個位點表現(xiàn)為單態(tài)性位點，30個位點出現(xiàn)二等位基因型。該小鼠群體平均觀測等位基因數(shù)為1.673 9，平均有效等位基因數(shù)為1.376 9，平均雜合度為0.215 2，平均多態(tài)性信息含量為0.166 6。高度多態(tài)性位點(PIC>0.5) 有0個，中度多態(tài)性位點(0.25

而封閉群SICR小鼠在45個SNP位點中，20個位點表現(xiàn)為單態(tài)性位點，25個位點出現(xiàn)二等位基因型。該小鼠群體平均觀測等位基因數(shù)為1.555 6，平均有效等位基因數(shù)為1.220 9，平均雜合度為0.143 2，平均多態(tài)性信息含量為0.119 9。高度多態(tài)性位點(PIC>0.5) 有0個，中度多態(tài)性位點(0.25

表1 封閉群小鼠3個群體在45個SNP位點上的等位基因頻率

注：“*”標(biāo)注為篩選的15個用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的位點；“#”標(biāo)注為篩選的20個用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的位點

Note：“*”means 15 loci used for population genetic structure analysis；“#”means 20 loci used for population structure analysis

表2 封閉群SKM小鼠在45個SNP位點上的等位基因數(shù)、平均雜合度和多態(tài)性信息含量Table 2 Number of allele, average heterozygosity and polymorphism information content (PIC)of 45 SNP loci in SKM mice

注：Na：等位基因數(shù)；Ne：有效等位基因數(shù)；Ho：觀測雜合度；He：期望雜合度；Ha：平均雜合度；SI：香隆指數(shù)；PIC：多態(tài)性信息含量

Note: Na:Number of allele; Ne:Number of effective allele; Ho: Observed heterozygosity; He: Expected heterozygosity; Ha: Average heterozygosity; SI: Shannon’s index; PIC: Polymorphism information content

而封閉群BICR小鼠在45個SNP位點中，22個位點表現(xiàn)為單態(tài)性位點，23個位點出現(xiàn)二等位基因型。該小鼠群體平均觀測等位基因數(shù)為1.5111，平均有效等位基因數(shù)為1.2851，平均雜合度為0.1699，平均多態(tài)性信息含量為0.1375。高度多態(tài)性位點(PIC>0.5)有0個，中度多態(tài)性位點(0.25

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

利用Popgen1.32，計算SKM小鼠45個SNP位點的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的P值。結(jié)果有2個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡，25個位點在群體遺傳中處于Hardy-Weinberg遺傳平衡，各位點的P值見表2中所示。同樣計算SICR、BICR中Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的P值。顯示分別有0和1個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡，11和17個位點在群體遺傳中處于Hardy-Weinberg遺傳平衡。

2.4 SNP位點與微衛(wèi)星DNA和生化位點方法的比較

我們將SNP位點的檢測結(jié)果與前期STR和生化位點檢測同一群體的結(jié)果進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)，無論是SNP還是STR位點進行群體遺傳檢測，用雜合度來評價三個群體的遺傳多樣性時，趨勢相同，均為SKM >BICR >SICR；而如果以香隆信息指數(shù)(SI)來評價時，SNP的檢測結(jié)果與雜合度評價的趨勢相同，但STR的結(jié)果卻不同，變?yōu)锽ICR >SICR >SKM。我們進行基因頻率排序并去除在群體中單態(tài)的SNP 位點，即用基因頻率相對高的20和15個SNP位點計算群體遺傳參數(shù)時，各遺傳參數(shù)的絕對值有所上升，尤其是SI值與STR的檢測結(jié)果更趨接近(表3)。在對群體的雜合性和均一性評價時，仍然是SKM群體的多樣性(He)和均一性(SI)均為最好。

表3 同一群體分別用SNP、STR和生化位點檢測的遺傳參數(shù)比較

注：Na：等位基因數(shù)；Ne：有效等位基因數(shù)；Ho：觀測雜合度；He：期望雜合度；Ha：平均雜合度；SI：香隆信息指數(shù)；PIC：多態(tài)性信息含量

Note: Na: Number of allele; Ne: Number of effective allele; Ho: Observed heterozygosity; He: Expected heterozygosity; Ha: Average heterozygosity; SI: Shannon’s index; PIC: Polymorphism information content

3 討論

昆明小鼠(KM)和ICR小鼠，廣泛應(yīng)用于藥物實驗、生物制品及化妝品的鑒定、評價和篩選實驗中，是我國應(yīng)用最廣泛的封閉群小鼠[8]。為了保證實驗數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性，需要定期對KM和ICR小鼠乃至所有封閉群實驗動物實施遺傳質(zhì)量檢測[9]，來監(jiān)測其遺傳穩(wěn)定性[10]。單核苷酸多態(tài)性作為第三代遺傳標(biāo)記物在小鼠近交系遺傳研究中已經(jīng)得到應(yīng)用，國內(nèi)有多位研究者采用SNP對常用近交系小鼠的遺傳質(zhì)量狀況進行了分析，表明SNP可用于小鼠遺傳質(zhì)量檢測[3, 11-12]。MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)具有分析速度快、準(zhǔn)確、分辨率高、自動化、靈敏等特點，已經(jīng)成為快速、準(zhǔn)確檢測蛋白質(zhì)和核酸分子的技術(shù)，是一種理想的SNP檢測方法。因此本研究選取45個SNP位點，運用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對來自上海、北京的3個封閉群小鼠遺傳狀況分析，來探索SNP在封閉群小鼠遺傳質(zhì)量狀況分析中的應(yīng)用。

本研究選取位于小鼠1～20號染色體上的45個SNP位點，保證標(biāo)記物對基因組的代表性及研究結(jié)果的可靠性。從我們的結(jié)果可知(表1)，在3個群體中45個位點的基因頻率顯示，僅在KM小鼠群體中呈單態(tài)的位點有3個，相反僅在ICR小鼠群體中呈單態(tài)的位點有8個，此外，雖然rs3089604位點在ICR和KM群體都呈現(xiàn)單態(tài)，但基因型則完全不同。所以我們認(rèn)為可以參考以上位點在兩種群體中的等位基因頻率的不同對ICR和KM小鼠群體進行辨別，即這些位點有可能作為ICR和KM兩個品系的鑒定依據(jù)，這對于同為白色小鼠的KM和ICR非常有意義。

有效等位基因數(shù)和期望雜合度是反映群體遺傳變異大小的指標(biāo)。但由于SNP是二等位基因型，所以其有效等位基因數(shù)偏低，但也在一定程度上反映群體中等位基因的分布情況。本實驗中3個封閉群中平均觀測等位基因數(shù)分別為SKM 1.6739、SICR 1.5556和BICR 1.5111，群體觀測等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)有偏差，說明所檢測的SNP位點的等位基因在群體基因組中的分布還不夠均勻[7]。有多個遺傳標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為一個較好的封閉群其平均雜合度在0.5～0.7之間，而本實驗中SKM、SICR和BICR小鼠群體平均雜合度絕對數(shù)值偏低，用15個SNP計算后雖然數(shù)值有所升高，也遠遠達不到0.5。究其原因一方面可能是我們選的部分位點在兩個封閉群中為單態(tài)；另一方面也可能是由于遺傳標(biāo)記本身的性質(zhì)決定，STR本身就是多等位基因的，有時候一個位點的等位基因數(shù)能達到十幾甚至幾十個[13]，而SNP只有兩個等位基因，這說明用不同的遺傳標(biāo)記檢測封閉群時可能不應(yīng)以雜合度的絕對值作為其雜合性和多樣性的判定標(biāo)準(zhǔn)。盡管如此，進行3個群體平均雜合度比較時，SNP位點的檢測結(jié)果與STR的檢測結(jié)果趨勢一致，即SKM>BICR>SICR，從等位基因數(shù)和平均雜合度角度可以認(rèn)為SKM小鼠的遺傳多樣性高于北京和上海的ICR小鼠群體。但是我們發(fā)現(xiàn)，用香隆信息指數(shù)(SI)來評價時，SNP的檢測結(jié)果與等位基因數(shù)和平均雜合度判斷的趨勢相同，而STR的結(jié)果卻不盡相同。我們知道，SI代表了等位基因在群體內(nèi)個體分配的均勻性，這可能說明所選SNP和STR位點在KM和ICR兩個群體中的均勻性不同。

總之，本研究表明在封閉群小鼠遺傳狀況的分析中，SNP可以作為一項遺傳標(biāo)記來反應(yīng)其遺傳狀況，而且有些SNP位點可能具有進行封閉群小鼠品系鑒定的潛在應(yīng)用前景。另外本研究所選的位點中有部分位點屬于單態(tài)性，在群體遺傳中可以適當(dāng)舍棄，有必要開發(fā)更多的SNP位點及群體分析擴展SNP在小鼠封閉群中的應(yīng)用前景。