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    畢赤酵母展示稻米脂肪酶催化乙酸乙酯研究

    2018-08-20 06:57:46鄭瑞娜
    食品與生物技術(shù)學報 2018年5期
    關(guān)鍵詞:脂肪酶稻米乙酸

    焦 玲,謝 定,文 李,姜 博,陳 平,鄭瑞娜

    (長沙理工大學 化學與生物工程學院,長沙 湖南410114)

    乙酸乙酯又名醋酸乙酯,英文名Ethyl Acetate,具有水果香味,外觀為無色透明液體。乙酸乙酯是一種非常重要的有機化工原料,同時,還是釀酒行業(yè)常用的調(diào)香物質(zhì),存在于所有的白酒之中[1,3]。目前在我國乙酸乙酯的生產(chǎn)基本上都是通過傳統(tǒng)方式在無機催化劑存在條件下化學合成,國際上也有少量從天然植物中分離提取方法來獲得[2]。而和化學合成法相比,酶法生物合成的乙酸乙酯不僅被認為是高質(zhì)量的天然產(chǎn)品,而且具有反應條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、專一性好、易提取、易控制等優(yōu)點,被看成是很有希望工業(yè)化的新途徑[3]。稻米脂肪酶是一類具有高活性的可以催化多種物質(zhì)的生物催化劑,利用酵母展示技術(shù),本實驗室在人工合成酵母菌壁蛋白 (GCW14)與稻米脂肪酶 (RL)組合基因(GCW14-RL)后,將其亞克隆到pPIC9k載體后轉(zhuǎn)化到GS115酵母菌中,成功構(gòu)建了pPIC9k-GCW14-Rlipase載體,并將RL展示在畢赤酵母GS115表面[4-5],再將其進行應用。

    本文作者將高密度發(fā)酵得到的畢赤酵母發(fā)酵液通過冷凍離心制得酵母全細胞[5],再將其用于催化,確定了反應最佳的稻米脂肪酶的酶活、底物摩爾比、反應溫度、反應時間和3A分子篩添加量等,以及采用不同來源的脂肪酶對催化合成乙酸乙酯的影響。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與儀器

    化學試劑:乙酸正戊酯(色譜純):TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品;乙酸乙酯(色譜純):天津市化學試劑研究所提供。正己烷(分析純)、無水乙醇(分析純)、乙酸(分析純):國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品;展示稻米脂肪酶的畢赤酵母全細胞催化劑為本實驗室自制[4]。

    儀器:GC-14C型氣相色譜儀(配氫火焰離子化檢測器(FID)、N2000色譜工作站):日本島津公司產(chǎn)品;色譜柱 (SUPELCOWAX-10 30 m×0.32 mm×0.25 μm):中國科學院蘭州化學物理研究所提供;DT5-1型低速臺式離心機:北京時代北利離心機有限公司產(chǎn)品;XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋:北京永光明醫(yī)療儀器廠制造。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 稻米脂肪酶酶活測定 采用對硝基苯酚法[6]。酶活力測定反應體系總體積為10 mL,包括1 mL p-NPP底物溶液(50 mmol/L)以及8 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)及1 mL菌懸液;反應體系混勻后在加熱振蕩器中35℃,800 r/min預熱5 min后,加入酶液進行反應,10 min后立即沸水浴加熱終止反應,12 000 r/min離心終10 min取上清液在405 nm

    式(1)中,X為脂肪酶活力,U/mL;c為脂肪酶濃度,μmol/mL;V 為脂肪酸溶液的體積,mL;V′為酶液的用量,mL;t為作用時間,min。

    一個脂肪酶水解活力單位(U)定義為:在當前反應條件下,1分子酶每分鐘催化水解底物p-NPP生成 1 μmolp-NP所需的酶量。

    1.2.2 乙酸乙酯的合成 稻米脂肪酶催化乙酸乙酯的酯合成反應過程為,在150 mL的具塞三角瓶中,加入3.4 mL乙酸、2.9 mL無水乙醇和15 mL正己烷組成非水相酯化反應體系,在30℃的溫度下預熱搖勻,30 min后加入酶活為6 300 U/g的稻米脂肪酶和1.2 g的3A分子篩以移走產(chǎn)物中的水分。在35℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫搖床上振蕩反應,定時取樣經(jīng)GC分析檢測并測定該酶催化酯化合成反應體系中乙酸的轉(zhuǎn)化率。

    1.2.3 反應轉(zhuǎn)化率的測定 將乙酸乙酯和底物測得的峰面積帶入標準曲線擬合的線性方程,算出在反應體系中的各個物質(zhì)的摩爾濃度。處測定吸光度A405值。酶活力計算公式如下:

    式(2)中,R為轉(zhuǎn)化率;M0為乙酸乙酯摩爾濃度;M1為生成的乙酸乙脂的摩爾濃度;M2為反應后乙酸剩余的摩爾濃度。

    1.2.4 GC色譜分析 N2000色譜工作站。采用程序升溫:起始柱溫55℃,恒溫1 min,以2℃/min升溫至80℃,恒溫2 min,再以20℃/min升溫至180℃,保持5 min;進樣口溫度:200℃;采用氫焰離子化檢測器 (flame ionizationdetector,F(xiàn)ID), 檢測器溫度:220 ℃;進樣方式:分流進樣,分流體積比:10∶1;進樣量:1 μL;載氣:氫氣;流量:60 KPa;空氣流量:50 KPa。乙酸正戊酯為內(nèi)標,內(nèi)標法測定酯的含量,每個樣品重復測定3次。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 稻米脂肪酶的酶活對合成乙酸乙酯的影響

    按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應體系,當反應溫度為35℃、反應時間為6 h,分別取酶活為 6 300、7 8750、10 500、15 750 U/g和31 500 U/g的稻米脂肪酶進行酶促酯合成反應,乙酸轉(zhuǎn)化率隨稻米脂肪酶的酶活的變化如圖1所示。

    結(jié)果表明,稻米脂肪酶合成乙酸乙酯的反應速度隨著酶活的增加而加快,當?shù)久字久该富顝? 300 U/g增加到15 750 U/g時,反應速率逐漸增大,乙酸轉(zhuǎn)化率從63.95%上升到87.94%,當?shù)久字久该富钸_到15 750 U/g時,反應速度達到最大,當?shù)久字久该富顝?5 750 U/g增加到31 500 U/g時,其反應速率變化很小。若再增加稻米脂肪酶的酶活使得脂肪酶相對底物是過量的,而酶相對于底物過量時,所有的底物都已經(jīng)與脂肪酶活性中心結(jié)合,使得過量的酶對于反應沒有貢獻,出于反應轉(zhuǎn)化率和工業(yè)化成本的考慮,因此,在所選底物濃度范圍內(nèi),選擇稻米脂肪酶酶活為15 750 U/g最為合適。

    2.2 酸醇摩爾比對合成乙酸乙酯的影響

    由于乙酸和乙醇都是具有較強極性的有機化合物,通過控制乙酸和乙醇在反應體系中的摩爾比,不僅可以改變反應速率,縮短反應所需時間,還可以有效的促進反應向生成乙酸乙酯的方向進行。因此,本作者通過對幾種不同的酸醇摩爾比進行比較,以確定反應最佳的酸醇摩爾比。在15 mL正己烷中固定加入2.9 mL乙醇、酶活為15 750 U/g稻米脂肪酶、1.2 g 3A分子篩,通過改變反應體系中的乙酸量來調(diào)節(jié)酸醇的摩爾比,結(jié)果如圖2所示。

    圖2 酸醇摩爾比對合成乙酸乙酯的影響Fig.2 Effect of the molar ratio of acetic acid toethanol on the synthesis of ethyl acetate

    對比這5組實驗結(jié)果可以看出,在酸醇摩爾比為1.2∶1.0時,其乙酸轉(zhuǎn)化率達最大值,其轉(zhuǎn)化率高達89.43%,在酸醇摩爾比為1.4∶1.0時的乙酸轉(zhuǎn)化率在5組實驗中是最慢的,這表明乙酸的濃度過高,對脂肪酶的合成活性產(chǎn)生了負面影響,導致轉(zhuǎn)化率偏低。 在酸醇摩爾比為 1∶1、1∶1.2、1∶1.4 這 3 組實驗中,乙酸轉(zhuǎn)化率與之相比逐漸的下降,這是因為反應體系中底物濃度過低,降低了酶與底物接觸并催化其發(fā)生反應的概率,從而無法充分發(fā)揮其催化活性。因此,選取1.2∶1的酸醇摩爾比定為最適稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的實驗條件。

    2.3 溫度對合成乙酸乙酯的影響

    按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應體系,每瓶加入稻米脂肪酶的酶活量為15 750 U/g、3A分子篩1.2 g,當反應溫度分別為25、30、35、40 ℃和 45 ℃時,乙酸轉(zhuǎn)化率隨時間的變化如圖3所示。

    圖3 溫度對合成乙酸乙酯的影響Fig.3 Effect of temparature on the synthesis of ethyl acetate

    結(jié)果表明,溫度對稻米脂肪酶催化反應速度有很大的影響。隨著反應溫度的升高,乙酸轉(zhuǎn)化率有所提高,當反應溫度為40℃時,乙酸轉(zhuǎn)化率達到最大值,然而當溫度提高到45℃時,乙酸轉(zhuǎn)化率有明顯下降。這是因為高溫可以提高反應初速度,因此在反應初始階段溫度越高,乙酸的轉(zhuǎn)化率越高,然而提高溫度同樣也會加快酶失活,使得反應速率迅速下降。因此,從降低能量消耗的角度考慮,選取40℃作為最優(yōu)反應溫度。

    2.4 反應時間的影響

    按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應體系,每瓶加入稻米脂肪酶的酶活量為15 750 U/g、3A分子篩1.2 g,當脂肪酶反應溫度為40℃時,反應時間對乙酸轉(zhuǎn)化率的影響如圖4所示。

    圖4 反應時間對合成乙酸乙酯的影響Fig.4 Effect of time on the synthesis of ethyl acetate

    從圖4看出,在加入稻米脂肪酶后0~4 h內(nèi),乙酸轉(zhuǎn)化率隨時間變化呈直線上升,隨著時間的推移,上升趨勢漸緩,當?shù)竭_4 h以后,乙酸轉(zhuǎn)化率已基本穩(wěn)定。由于反應產(chǎn)物的累加,一般情況下,反應時間越長,產(chǎn)物越多。但考慮到時間成本,經(jīng)濟成本,當反應進行4 h后,乙酸轉(zhuǎn)化率已達到89.93%,與最終趨于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化率相差不大。因此,選取反應時間為4 h較為合適。

    2.5 3A分子篩添加質(zhì)量的影響

    按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應體系,在反應溫度為35℃、稻米脂肪酶的酶活為15 750 U/g時,3A分子篩對乙酸轉(zhuǎn)化率的影響如圖5所示。

    圖5 3A分子篩的添加質(zhì)量對合成乙酸乙酯的影響Fig.5 Effect of 3A molecular sieve on the synthesis of ethyl acetate

    從上圖可以看出,在分別加入3A分子篩0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 g 時,乙酸轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出升高趨勢,乙酸乙酯的純度有所提高,當分子篩添加質(zhì)量達到1.2 g(相當于質(zhì)量分數(shù)8%的添加量)時乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率達最大值,這是因為3A分子篩能夠吸附反應體系中的一部分水分,使得反應能夠向生成乙酸乙酯的方向進行,當繼續(xù)向反應體系加入分子篩時,由于反應體系中的水已被分子篩吸取使反應趨向生成乙酸乙酯的方向達到平衡,此時的乙酸乙酯含量已經(jīng)達到一個穩(wěn)定值。因此,選取1.2 g(相當于質(zhì)量分數(shù)8%的添加量)分子篩為最合適的分子篩添加質(zhì)量。

    2.6 不同脂肪酶對合成乙酸乙酯的影響

    按1.2.2的方法構(gòu)成稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的反應體系,分別測定稻米脂肪酶、國產(chǎn)堿性脂肪酶和標準脂肪酶3種脂肪酶在正己烷體系中的乙酸轉(zhuǎn)化率,考察3種不同來源的脂肪酶對合成乙酸乙酯的影響。不同脂肪酶對乙酸轉(zhuǎn)化率的影響如圖6所示。

    圖6 不同脂肪酸對合成乙酸乙酯的影響Fig.6 Effect of different lipase on the synthesis of ethyl acetate

    上圖可知,在堿性脂肪酶、標準脂肪酶和稻米脂肪酶3種酶中,就乙酸轉(zhuǎn)化率而言,堿性脂肪酶的效率最低,稻米脂肪酶比標準脂肪酶的催化合成效率略高。

    3 結(jié) 語

    通過研究發(fā)現(xiàn),在有機溶劑中決定酯合成反應的關(guān)鍵還是脂肪酶的選擇。不同來源的脂肪酶,由于其底物特異性的差異導致其合成酯的能力也不一樣。即使是同種脂肪酶,根據(jù)其活力的大小也會對目的產(chǎn)物的合成造成影響。根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)的需要,選擇一種適合目的產(chǎn)物高效合成的脂肪酶至關(guān)重要。在有機溶劑正己烷中,畢赤酵母細胞表面的稻米脂肪酶作為催化劑催化乙酸和乙醇合成乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率高,是一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的途徑。通過單因素實驗,確定了稻米脂肪酶添加量、反應溫度、反應時間、底物摩爾比、3A分子篩的添加質(zhì)量等一系列影響稻米脂肪酶合成乙酸乙酯的因素,確定了反應最優(yōu)工藝條件:在15 mL正己烷中,稻米脂肪酶的酶活為15 750 U/g,3A分子篩的添加質(zhì)量為1.2 g(相當于8 g/mL的添加質(zhì)量濃度),底物摩爾比(乙酸∶乙醇)為1.2∶1,在 40℃條件下振蕩反應4 h,合成乙酸乙酯的的轉(zhuǎn)化率可達到90.92%。在測定稻米脂肪酶催化反應體系中乙酸乙酯濃度時利用毛細管氣相色譜法可更有效、快速、準確地研究酶法合成乙酸乙酯的相關(guān)課題,也可在該法的工業(yè)化生產(chǎn)中,為乙酸乙酯質(zhì)量分析提供借鑒。

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