胃脂肪酶在胃癌中的表達及臨床意義

李 超，王 昕，康 倩，潘元明，楊桂彬

1.北京大學航天臨床醫(yī)學院 航天中心醫(yī)院消化科，北京100049； 2.陸軍總醫(yī)院消化內(nèi)科

胃癌作為我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率居高不下[1]。臨床上缺乏胃癌早期診斷和預后評估等方面有效的監(jiān)測手段和相關(guān)標志物，因此，研究可用于腫瘤高危人群預警、臨床分型和預后判斷的分子標志物是臨床診療的關(guān)鍵策略。胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程是一個包括遺傳、環(huán)境、感染等多因素協(xié)同作用的動態(tài)演變過程，其中伴隨了大量基因調(diào)控和表達異常積累。相關(guān)研究[2-5]表明，胃癌組織中胃脂肪酶(lipase type F, LIPF)表達較正常組織顯著降低，可能與胃癌生物學行為有關(guān)。但是LIPF在細胞水平的表達情況及其在胃癌組織中的差異表達與臨床相關(guān)性評價報道較少。本研究通過檢測LIPF在配對胃癌組織和細胞系中的表達，探討其與胃癌臨床病理特征、預后的相關(guān)性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1組織芯片組織芯片標本來源于2006年6月至2013年6月陸軍總醫(yī)院和航天中心醫(yī)院胃癌患者手術(shù)切除后的石蠟包埋組織，包括胃癌組織122例和癌旁正常胃組織120例。術(shù)前未經(jīng)放化療，腫瘤的病理分期根據(jù)美國抗癌聯(lián)合會AJCC的pTNM 法。所有病例均具有詳細臨床病理資料及隨訪資料。隨訪時間為從手術(shù)日期至病例死亡或2013年12月31日，隨訪時間為1～81個月(平均46.3個月)。平均患病年齡54歲，以中老年人群為主。

1.2細胞系及細胞培養(yǎng)實驗選取5株胃癌細胞系及1株永生化正常胃黏膜細胞系，均為北京大學臨床腫瘤學院腫瘤防治研究所分子生物學實驗室保管和惠贈。其中N87為高分化胃腺癌細胞系，SGC7901為中分化胃腺癌細胞系，AGS、BGC823、MGC803為低分化胃腺癌細胞系，GES1為人永生化正常胃黏膜細胞系。BGC823、MGC803、SGC7901、GES1采用含質(zhì)量濃度為50 g/L胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司)培養(yǎng)，AGS、N87采用含質(zhì)量濃度為10 g/L FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加100 U/ml青霉素和100 g/L鏈霉素，于37 ℃, 體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3免疫組織化學染色免疫組化染色采用兩步法。主要步驟為：(1)烤片：4 μm石蠟切片于80 ℃烤片2 h；(2)脫蠟：二甲苯脫蠟2次，每次20 min；(3)水化：梯度酒精(100%、95%、80%)依次水化5 min；(4) 抗原修復：切片置于枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)的抗原修復液中，用高壓法進行抗原修復150 s。自然冷卻后，1×PBS洗(5 min×3次)；(5)消除內(nèi)源性過氧化物酶活性：質(zhì)量濃度為30 g/L過氧化氫溶液孵育10～15 min，蒸餾水沖洗后，用1×PBS洗(5 min×3次)；(6) 封閉：質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉配成牛奶封閉液，室溫封閉1 h。傾去多余牛奶，用1×PBS洗(5 min×3次)；(7)一抗：用一抗稀釋液將兔抗人多克隆抗體LIPF(BS8649，Bioworld Technology, Inc,南京)稀釋至1∶200，滴加一抗，4 ℃過夜。傾去一抗，用1×PBS洗(5 min×3次)；(8) 二抗：滴加super enhance，室溫20 min，1×PBS洗(5 min×3次)；滴加Polymer-HRP，室溫30 min。傾去二抗，1×PBS洗(5 min×3次)；(9)顯色：用新鮮配置的DAB(PV-8000，北京中杉金橋生物科技有限公司)顯色液顯色，顯微鏡下控制顯色時間，終止反應時自來水充分沖洗；(10)復染：蘇木素(DAKO)復染，自來水沖洗，質(zhì)量濃度為10 g/L鹽酸酒精去浮色10 s，溫水返藍；(11)水化透明：梯度酒精(80% 5 min，95% 5 min，100%10 min，100%10 min)水化，二甲苯透明(30 min)；(12)封片：中性樹膠封片，鏡下觀察結(jié)果。PBS代替一抗作為陰性對照。LIPF蛋白為胞漿著色，棕黃色為陽性著色。根據(jù)著色細胞的陽性百分比可分別評為0分(<5%，陰性)、1分(5%～25%，散發(fā))、2分(26%～50%，局部)、3分(51%～75%，彌漫)和4分(>75%)。根據(jù)染色的強度可分別評為0分(不著色)、1分(弱著色)、2分(中度著色)和3分(強著色)。將著色細胞的陽性百分比和染色強度的評分相乘，最后LIPF的評分分為0～12分，分別對應的4種表達強度：陰性：-(評分0～1分)、弱陽性：+ (評分2～4分)、中度陽性：++ (評分5～8分)和強陽性+++(評分9～12分)。陰性和弱陽性定義為低表達，中度陽性和強陽性定義為高表達。

1.4實時定量PCR采用Trizol標準法(Invitrogen，USA)提取細胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應采用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(貨號AE301， Transgen Biotech，北京)進行實驗，LIPF與β-actin擬實時定量PCR (ABI7500，Carlsbad, CA, USA)進行檢測，分析LIPF基因在不同胃細胞系中的差異表達。所用檢測試劑為北京全式金基因?qū)崟r定量試劑盒(TransStart Top Green qPCR SuperMix，貨號AQ131，北京)。LIPF引物與內(nèi)參引物β-actin均由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。LIPF的上游引物序列為：5′-TGAGGAAACTGCAGGTCCAA-3′：下游引物序列為：5′-GTCACTTCAGGGCTTCCAGG-3′，PCR擴增長度116 bp。內(nèi)參基因β-actin，上游引物序列為：5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游引物序列為：5′-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，PCR擴增長度150 bp。實時定量PCR的擴增條件95 ℃，20 s，隨后95 ℃，3 s變性，退火延伸60 ℃，30 s，40個循環(huán)，進行熒光收集和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.5Westernblotting通過BCA方法進行相關(guān)細胞系和8例新鮮配對胃癌組織的蛋白進行定量，以每個樣品40 μg經(jīng)過質(zhì)量濃度為100 g/L的丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(Bioworld，貨號BS8649)，一抗稀釋濃度1∶800；內(nèi)參β-actin為一抗(Sigma, 貨號：A2228)，稀釋濃度1∶10 000。二抗為不同種屬的HRP標記，1∶1 000稀釋孵育PVDF膜40 min，經(jīng)過PBS-吐溫洗滌3次，每次10 min。PVDF膜與免疫印跡發(fā)光試劑(ECL)反應，X射線片曝光、顯影、定影后進行分析。

2 結(jié)果

2.1LIPF在胃癌及癌旁正常組織中的表達在染色條件一致的情況下，LIPF蛋白主要以細胞漿著色為主(見圖1)。在122例胃癌組織中，LIPF高表達41例(33.6%)，低表達81例(66.4%)。120例癌旁正常組織中，高表達110例(91.7%)，低表達10例(8.3%)。LIPF在胃癌組織中的表達率顯著低于癌旁正常組織(P<0.001)。

圖1LIPF在胃癌及癌旁正常組織中的差異表達(400×)A：癌旁正常組織(+++)；B：胃癌組織(-)

Fig1LIPFdifferentiallyexpressedinadjacentnormaltissuesandgastriccancertissues(400×) A: adjacent normal tissue(+++); B: gastric cancer tissue (-)

2.2LIPFmRNA在胃細胞系中的表達LIPF mRNA在胃癌細胞系BGC823、MGC803、SGC7901中微弱表達，在胃癌細胞系A(chǔ)GS、N87中不表達，與各胃癌細胞系相比，LIPF在永生化正常胃黏膜細胞系GES1中表達較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖2)。

注：與各胃癌細胞系相比，**P<0.01。

2.3LIPF蛋白在胃癌細胞系和組織中低表達LIPF蛋白在永生化正常胃黏膜細胞系GES1中高表達，在胃癌細胞系MGC803中低表達，在BGC823、SGC7901、AGS、N87中幾乎不表達(見圖3)，與實時定量PCR的結(jié)果一致。8例新鮮配對胃癌組織中，LIPF在癌旁正常組織中的表達高于配對胃癌組織。同時在彌漫型胃癌組織C1、C2及混合型彌漫為主的胃癌組織C3、C5中LIPF不表達，且腫瘤浸潤分級較高；與其相比，腸型胃癌組織C6、C7、C8 及混合型腸型為主的胃癌組織C4中LIPF表達較高，且浸潤分級較低(見圖4、表1)。

圖3 Western blotting檢測胃癌細胞系中LIPF蛋白的表達Fig 3 The expression of LIPF protein in gastric cell line detected by Western blotting

圖4 Western blotting檢測配對胃癌組織中LIPF蛋白的表達 N：癌旁正常組織；C：胃癌組織Fig 4 The expression of LIPF protein in paired gastric cancer tissues detected by Western blotting N: adjacent normal tissues; C: gastric cancer tissues

2.4Kaplan-Meier法對胃癌患者術(shù)后5年內(nèi)生存分析結(jié)合胃癌患者的預后資料，分析LIPF表達較高的胃癌患者及LIPF表達較低的胃癌患者的5年內(nèi)生存率，發(fā)現(xiàn)高表達LIPF胃癌患者5年內(nèi)生存率顯著高于低表達組(P<0.001，見圖5)。

圖5 Kaplan-Meier法分析LIPF表達與預后的關(guān)系Fig 5 Kaplan-Meier analysis of the relationship between LIPF expression and prognosis

2.5LIPF在胃癌組織中的表達與臨床病理特征的關(guān)系LIPF在胃癌組織中的表達與胃癌組織的浸潤深度、Lauren 分型有明顯相關(guān)性(P<0.05)，與年齡、性別、病情進展(TNM分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P>0.05)(見表2)。

表1 8例胃癌患者的臨床資料Tab 1 Clinical data of 8 patients with gastric cancer

表2LIPF在胃癌組織中的表達與臨床病理指標的關(guān)系

Tab 2 The relationship between the expression of LIPF and the clinicopathological indexes in gastric cancer 比例%

3 討論

胃癌是一類表觀調(diào)控與遺傳交互的多階段累積性疾病，受基因與環(huán)境異質(zhì)性的相互影響，呈現(xiàn)異常復雜的病理學類型。對胃癌特征基因進行有效的篩選和評估是胃癌早診和防治的基礎(chǔ)，而研究特征基因的表達變化與臨床特征的關(guān)系可為胃癌早期診斷、分子分型及預后評價等方面提供關(guān)鍵思路。相關(guān)研究比較了不同采樣部位、種族、研究平臺的胃癌GEO數(shù)據(jù)庫，通過對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫和表達譜芯片數(shù)據(jù)庫的綜合分析，發(fā)現(xiàn)LIPF基因在胃癌較癌旁正常組織表達顯著下調(diào)[2]。

LIPF基因位于10號染色體q23.31[6]，編碼的蛋白為LIPF，是人體內(nèi)除胰脂肪酶之外重要的脂肪消化酶。LIPF由1條含379個氨基酸殘基的多肽鏈構(gòu)成，主要由胃底黏膜的主細胞分泌產(chǎn)生。LIPF為耐酸性酶，在胃酸環(huán)境下穩(wěn)定，有研究[8]表明，其在pH=5時活性最強[7]，在pH=2.8時仍能保持較高活性。且LIPF在十二指腸中也可發(fā)揮水解脂肪的作用[9]，不受膽鹽影響[10]。正常情況下，其水解脂肪的作用可達整個胃腸道的10%～25%[11]。ROMO VAQUERO等[12]在動物模型中發(fā)現(xiàn)，抑制LIPF可大幅減少脂肪吸收，從而減緩體質(zhì)量增長。可見LIPF在脂肪消化中作用十分重要。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于胃癌中LIPF差異表達及其臨床意義的文獻報道較少。

本研究通過免疫組化方法檢測胃癌組織及癌旁正常組織中LIPF蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)LIPF蛋白在胃癌組織中的表達率顯著低于癌旁正常組織(P<0.001)。除了進行LIPF在配對胃癌組織中表達情況的檢測外，我們還選取常見5株胃癌細胞系及1株永生化正常胃黏膜細胞系GES1，檢測LIPF在胃細胞系中的表達情況。分別用實時定量PCR方法及Western blotting方法檢測LIPF mRNA及蛋白水平的表達，結(jié)果顯示，在永生化正常胃黏膜細胞系GES1中LIPF mRNA及蛋白水平的高表達，而在胃癌細胞系中，LIPF的蛋白水平及mRNA水平均呈低表達或幾乎不表達。這表明，LIPF在胃癌細胞系中表達水平也較低，與免疫組織化學檢測結(jié)果一致。

有研究[5]檢測胃癌組織中1 142個基因下調(diào)，其中LIPF mRNA表達下調(diào)最為顯著，這與我們檢測胃癌細胞系中LIPF mRNA的表達結(jié)果一致。LEE等[13]對胃液蛋白組學分析的結(jié)果顯示，在健康受試者中，LIPF是胃液的主要蛋白質(zhì)之一，而LIPF在胃癌患者的胃液中未被檢測到。最近有研究[14-15]結(jié)果顯示，LIPF蛋白在胃癌患者血清中差異表達，并在胃癌早期就已出現(xiàn)，且與在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胃癌中同時存在差異表達的MMP-1、Mucin-13 和cathepsin-B等基因不同，LIPF在胃癌中差異表達相對特異，其有望成為更為理想的胃癌血清學標志物。這與本研究在配對胃癌組織及胃癌細胞中采用Western blotting方法檢測LIPF蛋白表達結(jié)果較為一致。

此外， 結(jié)合臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，LIPF在胃癌組織中的表達與患者胃癌組織的浸潤深度、Lauren 分型有明顯相關(guān)性，與年齡、性別、病情進展(TNM分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。國內(nèi)相關(guān)研究[16]運用cDNA芯片進行彌漫型胃癌基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)其癌組織低表達的基因為204個，其中LIPF下調(diào)倍數(shù)位居第3位，與我們所測得的彌漫型胃癌組織中LIPF蛋白低表達的結(jié)果一致。

在進一步隨訪中發(fā)現(xiàn)， LIPF表達與胃癌患者預后密切相關(guān)，高表達LIPF組5年內(nèi)生存率顯著高于低表達組。結(jié)果提示，LIPF表達降低與胃癌患者的不良預后相關(guān)，可能作為潛在分子標志物參與胃癌的預后評價。

綜上所述，本研究表明，LIPF在胃癌組織中的表達較正常組織有所下降，LIPF的低表達對胃癌浸潤深度有促進作用，并與Lauren分型及不良預后密切相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)，LIPF在胃癌細胞系中也同樣存在一致性，提示LIPF可以作為胃癌相關(guān)分子標志物，為胃癌的診斷和防治提供新的臨床思路。LIPF在胃癌中表達水平降低一方面可能與胃癌組織中能量代謝異常有關(guān)，另一方面也可能與信號通路調(diào)控有關(guān)。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，包括LIPF在內(nèi)的8個胃癌差異表達基因聯(lián)合檢測可以使胃癌診斷準確性達到96%，且LIPF在胃癌中的差異表達與甲基化有緊密聯(lián)系。本研究結(jié)果及相關(guān)機制需要進一步深入研究。