天麻鉤藤飲對自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮細胞自噬相關信號通路Ca2+/AMPK/mTOR的影響

李云攀，劉美云

(1.濰坊護理職業(yè)學院，山東 濰坊 262500；2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院，山東 濰坊 262500)

高血壓是一種常見的嚴重危害人類身體健康的心血管疾病，其發(fā)病率和病死率逐年增加，呈年輕化趨勢顯著，給患者造成極大的醫(yī)療負擔[1]。相關研究表明，血管內(nèi)皮功能障礙是誘發(fā)和加重高血壓病的重要分子機制，在高血壓病理狀態(tài)下，血管活性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)等因素長期刺激血管壁，導致血管內(nèi)皮細胞外基質(zhì)異常降解和沉積、抗凝和促凝功能紊亂、血管收縮因子和血管舒張因子調(diào)節(jié)失衡，最后引發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙[2-4]。

此外，有文獻報道自噬與血管內(nèi)皮細胞功能密切相關，其對內(nèi)皮細胞增殖、黏附、分泌及血管形成等功能方面發(fā)揮著至關重要的作用[5-7]，而自噬是一把雙刃劍，基礎水平自噬能有效保護內(nèi)皮細胞功能與結(jié)構(gòu)受損，但自噬過度激活反而會加重高血壓病情。目前，中藥對高血壓自噬影響的文獻報道甚少，且血管內(nèi)皮功能障礙與高血壓自噬之間的發(fā)生機制亦未見相關實驗研究，因此，本文擬采用自發(fā)性高血壓模型大鼠，初步探討天麻鉤藤飲對自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮細胞自噬相關信號通路Ca2+/AMPK/mTOR的影響，以闡述其降壓機制與調(diào)控自噬的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF級京都種大鼠(wistarkyoto rat,WKY)10只、自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hyertensive rat,SHR)30只，體重180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物質(zhì)量合格證號為SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 藥物 天麻鉤藤飲由天麻9 g、鉤藤12 g、生決明18 g、黃芩9 g、梔子9 g、川牛膝12 g、桑寄生9 g、朱茯神9 g、杜仲9 g、夜交藤9 g、益母草9 g組成，統(tǒng)一購自北京同仁堂大藥房并符合國家藥典標準，尼莫地平片購自天津市中央藥業(yè)有限公司。

1.1.3 試劑 RIPA蛋白抽提試劑、HRP-山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，大鼠ANGⅡ、IL-1 ELISA kit購自武漢博士德生物工程有限公司，大鼠CaM ELISA kit購自武漢華美生物科技有限公司，兔抗大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ、腺苷酸活化蛋白酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)多克隆抗體購自美國Proteintech公司，其余常用試劑均為市場分析純。

1.1.4 儀器 BP98A型無創(chuàng)血壓檢測儀(北京軟隆科技有限責任公司)，GS-800型凝膠掃描成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，LA612型超純水儀(美國Elga公司)，PowerPac型電泳儀(美國Bio-Rad公司)，5427R型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendoff公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 將30只雄性SHR大鼠按體重隨機分為SHR組、尼莫地平組及天麻鉤藤飲組，另設正常對照組(WKY組)，每組10只。參照文獻[8]并按體表面積與人臨床等效劑量換算，中藥組大鼠灌胃給予天麻鉤藤飲生藥10.26 g/kg，西藥組大鼠灌胃給予尼莫地平5.4 mg/kg，WKY組和SHR組大鼠則給予等量蒸餾水，灌胃體積為10 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥6周。

1.2.2 大鼠血壓檢測 采用BP98A型無創(chuàng)血壓儀檢測各組大鼠尾動脈收縮壓，在清醒與非激怒狀態(tài)下，取連續(xù)3次大鼠尾動脈收縮壓的平均值作為其血壓，所有大鼠首次給藥前測定血壓，然后每隔2周于給藥1 h后測量血壓，并固定每次測量時間均在上午。

1.2.3 血漿血管緊張素Ⅱ、白細胞介素1、鈣調(diào)素含量檢測 各組動物給藥6周后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，肝素鈉抗凝，3 000 r/min離心10 min，收集血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測各組大鼠血漿中ANGⅡ(AngiotensinⅡ,ANG Ⅱ)、IL-(1Interleukin-1,IL-1)及CaM含量(Calmodulin,CaM)，具體操作步驟詳見ELISA試劑盒說明書。

1.2.4 自噬標志物、微管相關蛋白輕鏈檢測 各組動物給藥6周后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，即刻分離胸主動脈，置于離心管中，加入PMSF-RIPA(1︰100)試劑抽提總蛋白，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA試劑盒檢測自噬標志物(autophagy-related,Beclin-1)和微管相關蛋白輕鏈(microtubule-associated protein Ⅱ light chain-3,LC3-Ⅱ)蛋白含量。將蛋白樣本與上樣緩沖液混勻、變性后，以每孔60 μg加入至SDS-PAGE凝膠中，電泳、轉(zhuǎn)膜2.5 h，于搖床5% BSA室溫封閉1 h。加入一抗(Beclin 11︰1 000，LC3-Ⅱ1︰1 000，GAPDH 1︰1 000)4℃培養(yǎng)過夜，TBST洗3次×10 min，加入HRP-山羊抗兔二抗(1︰1 000)，室溫振搖培養(yǎng)1 h，TBST洗4次×10 min，ECL化學發(fā)光后通過蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)進行掃描，并計算各蛋白的相對光密度值。

1.2.5 自噬通路相關AMPK和mTOR蛋白檢測 同上操作抽提總蛋白后，離心、取上清，BCA試劑盒測定AMPK和mTOR蛋白含量，蛋白樣本與上樣緩沖液混合、變性，每孔60μg加入SDS-PAGE凝膠中，電泳、轉(zhuǎn)膜3 h，5% BSA封閉1 h，加入一抗(AMPK 1︰1 000，mTOR 1︰1 000，GAPDH 1︰1 000)4℃培養(yǎng)過夜，TBST洗3次×10 min，加入HRP-山羊抗兔二抗(1︰1 000)，室溫振搖培養(yǎng)1 h，TBST洗4次×10 min，ECL化學發(fā)光，最后采用蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)計算各蛋白的相對光密度值。

1.2.6 自噬通路相關AMPK和mTOR基因檢測 取各組大鼠胸主動脈，分別加入Trizol試劑，參照試劑盒步驟抽提總RNA，采用核酸定量儀測定其濃度及純度。進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應合成cDNA:42℃60 min、75℃ 5 min，然后擴展基因產(chǎn)物:95℃預變性35 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸60 s，共40次循環(huán)。其中內(nèi)參β-actin引物序列正向引物:5'-CATCGCTTGCGGCAGTCACCTG-3'，反向引物:5'-CGTACTGCGTGCGATGAGTCACTT-3'；AMPK引物序列正向引物:5'-CGACGTGGAGCTGTACTGACGT-3'，反向引物:5'-CATACTCAGTCAGATCTCTATC-3'；mTOR引物序列為正向引物:5'-TCGAGTGTTAGCCAC TATAG-3'，反向引物:5'-CCTATTATCGACGCATCCG A-3'。最后以內(nèi)參為對照計算各基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPFF 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，不同時間點的各組大鼠尾動脈收縮壓的比較采用重復測量設計的方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻鉤藤飲對SHR大鼠血壓的影響

4組大鼠給藥前、給藥2周、給藥4周及給藥6周后的血壓值比較采用重復測量設計的方差分析，結(jié)果:①不同時間點的血壓值有差異(F=42.282，P=0.000)；②不同組之間的血壓值有差異(F=10.518，P=0.004)；③不同組之間的血壓值變化趨勢有差異(F=217.009，P=0.000)。給藥2、4和6周后，與相應時間點WKY組比較，SHR組大鼠血壓增高(t=22.822、31.183和32.482，P=0.009、0.005和0.005)；與相應時間點SHR組比較，尼莫地平組大鼠血壓降低(t=14.342、40.932和20.683，P=0.019、0.003和0.010)，天麻鉤藤飲組大鼠血壓亦降低(t=9.226、11.389和13.494，P=0.039、0.028和0.021)，這提示天麻鉤藤飲對自發(fā)性高血壓大鼠具有降壓作用。見表1。

2.2 天麻鉤藤飲對SHR大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，給藥6周后，4組大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=16.073、10.052和28.712，P=0.001、0.004和0.000)；與WKY組比較，SHR組大鼠血漿中ANGⅡ、IL-1及CaM含量均增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=44.280、25.230和68.112，P=0.000、0.001和0.000)，與SHR組比較，尼莫地平組大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平均降低(t=18.819、10.415和41.320，P=0.001、0.004和0.000)，天麻鉤藤飲組大鼠上述3個因子水平亦降低(t=13.374、9.574和7.711，P=0.003、0.009和0.008)，這提示天麻鉤藤飲能有效降低SHR大鼠炎癥水平、抑制血管內(nèi)皮因子過度激活和細胞內(nèi)鈣增加。見表2。

表1 天麻鉤藤飲對SHR大鼠尾動脈收縮壓的影響(n =10，mmHg，±s)

表1 天麻鉤藤飲對SHR大鼠尾動脈收縮壓的影響(n =10，mmHg，±s)

注:1)與WKY組比較P ＜0.05；2)與SHR組比較P ＜0.05

組別給藥前給藥2周給藥4周給藥6周SHR組166.2±9.61)182.7±14.31)185.6±11.71)191.5±13.61)尼莫地平組(5.4 mg/kg)167.9±10.41)141.6±12.22)131.3±8.92)145.9±10.82)天麻鉤藤飲組(10.26 g/kg)169.1±11.31)152.1±10.02)156.6±9.22)154.0±11.32)WKY組127.7±8.5135.5±9.4138.4±8.8137.1±9.4

表2 天麻鉤藤飲對SHR大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平的影響 (n =10，pg/ml，±s)

表2 天麻鉤藤飲對SHR大鼠血漿ANGⅡ、IL-1及CaM水平的影響 (n =10，pg/ml，±s)

注:1)與WKY組比較P ＜0.05；2)與SHR組比較P ＜0.05

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2.3 天麻鉤藤飲對自噬標志物Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，給藥6周后，SHR組大鼠血管內(nèi)皮細胞中自噬標志物Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達與WKY組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=29.897和27.396，P=0.005和0.006)，SHR組上調(diào)，表明SHR大鼠血管內(nèi)皮細胞中自噬被激活；尼莫地平組大鼠自噬標志物Beclin-1蛋白表達與SHR組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.824，P=0.041)，尼莫地平組降低；天麻鉤藤飲組大鼠Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達均降低(t=22.615和18.340，P=0.009和0.013)，這提示天麻鉤藤飲能有效降低SHR大鼠自噬水平。見圖1。

2.4 天麻鉤藤飲對AMPK和mTOR表達的影響

圖1 天麻鉤藤飲對血管內(nèi)皮細胞自噬標志物Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，給藥6周后，WKY組與SHR組大鼠血管內(nèi)皮細胞中自噬通路AMPK和mTOR比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=252.150和47.040，P=0.000和0.002)，SHR組表達上調(diào)；與SHR組比較，尼莫地平組大鼠自噬通路相關AMPK和mTOR蛋白表達降低(t=43.320和18.732，P=0.003和0.012)，天麻鉤藤飲組大鼠AMPK和mTOR蛋白表達亦降低(t=147.001和21.689，P=0.000和0.009)，這提示天麻鉤藤飲對自噬通路相關AMPK和mTOR蛋白具有調(diào)控作用。見圖2。

2.5 天麻鉤藤飲對自噬通路相關AMPK和mTOR基因表達的影響

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，給藥6周后，4組大鼠AMPK和mTOR基因表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=10.482和8.126，P=0.004和0.008)；WKY組與SHR組大鼠血管內(nèi)皮細胞自噬通路相關AMPK和mTOR mRNA比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=26.113和22.601，P=0.001和0.002)，SHR組表達上調(diào)；與SHR組比較，尼莫地平組大鼠自噬通路相關AMPK和mTOR mRNA表達均降低(t=14.530和9.125，P=0.003和0.011)，天麻鉤藤飲組大鼠上述兩基因表達水平亦降低(t=7.769和9.654，P=0.011和0.008)，這提示天麻鉤藤飲對自噬通路相關AMPK和mTOR基因具有明顯的調(diào)控作用。見表3。

圖2 天麻鉤藤飲對血管內(nèi)皮細胞自噬通路相關AMPK和mTOR蛋白表達的影響

表3 天麻鉤藤飲對血管內(nèi)皮細胞自噬通路相關AMPK、mTOR基因表達的影響 (n =10，±s)

表3 天麻鉤藤飲對血管內(nèi)皮細胞自噬通路相關AMPK、mTOR基因表達的影響 (n =10，±s)

注:1)與WKY組比較P ＜0.05；2)與SHR組比較P ＜0.05

組別AMPKmTOR SHR組1.637±0.2721)1.432±0.1871)尼莫地平組(5.4 mg/kg)0.924±0.1762)1.015±0.1492)天麻鉤藤飲組(10.26 g/kg)1.073±0.2212)0.987±0.1632)WKY組0.729±0.1440.842±0.106

3 討論

自噬是指細胞內(nèi)受損、變性及衰老的蛋白和細胞碎片被運輸?shù)饺苊阁w，并對其進行消化降解，以胞質(zhì)內(nèi)自噬體出現(xiàn)為標志的一種程序化的細胞自我降解過程[9]。在此過程中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白是哺乳動物自噬相關基因的編碼產(chǎn)物，兩者通過與哺乳動物空泡序列蛋白質(zhì)34(mammalian Vacuolar sorting proteins-34,mVps-34)、B細胞淋巴瘤蛋白2(B Cell Leukemia-2,Bcl-2)等因子相互作用，激活細胞自噬，故Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白常常作為自噬標志分子來檢測細胞自噬水平[10]。相關研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮功能障礙與高血壓病的發(fā)生密切相關，并且是后者的重要致病因素，在高血壓病理進程中，血管內(nèi)皮細胞與循環(huán)血液內(nèi)高濃度的AngⅡ直接接觸，刺激產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)、IL-1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子及細胞內(nèi)鈣離子[11-12]，而當Ca2+超載后，血漿中鈣調(diào)素CaM增加，又可激活鈣/鈣調(diào)蛋白激酶依賴性激酶β(Ca2+/calmodulin-dependent kinase kinase β，CaMKK-β)增加AMPK活性，然后磷酸化結(jié)節(jié)蛋白復合物2(tuberous sclerosis complex-2,TSC-2)進而抑制重組人表皮因子(reconstructed human epidermis,RHE)分子，通過負反饋抑制mTOR活性，最終激活細胞自噬[13-15]，因此自噬與高血壓發(fā)病機制密切相關，其可通過Ca2+/AMPK/mTOR信號途徑導致血管內(nèi)皮細胞壞死與凋亡，進而加重高血壓病情。

天麻鉤藤飲源自《雜病證治新義》，是目前臨床上一種治療高血壓病的經(jīng)典方，由天麻、鉤藤、生決明、黃芩、梔子、川牛膝、桑寄生、朱茯神、杜仲、夜交藤、益母草幾味藥組成，方中天麻、鉤藤平肝熄風，石決明平肝潛陽，黃芩、梔子清肝降火，川牛膝活血利水，桑寄生、杜仲補肝益腎，朱茯神、夜交藤寧心安神，諸藥合用，共奏平肝熄風、清熱活血、補益 肝腎之功效[8，16]。臨床研究表明，其降壓效果顯著，并能抑制患者細胞內(nèi)Ca2+釋放、降低血漿內(nèi)皮素(Endothelin,ET)、ANGⅡ含量及超敏C反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、TNF-α等炎癥因子水平，有效改善高血壓患者受損的血管內(nèi)皮功能及血管重塑[17]。本文實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尼莫地平、天麻鉤藤飲均能降低SHR大鼠尾動脈收縮壓和血漿ANGⅡ和CaM水平、下調(diào)血管內(nèi)皮細胞中自噬標志物Beclin-1和LC3-Ⅱ與自噬通路相關AMPK和mTOR蛋白及mRNA表達水平，這些結(jié)果提示抑制自噬相關信號通路與天麻鉤藤飲降壓機制存在一定的聯(lián)系。已知陽性藥尼莫地平屬于鈣通道拮抗劑，研究表明其能有效降低SHR大鼠血壓[18-19]，且尼莫地平可通過阻斷Ca2+/AMPK/mTOR信號通路從而抑制細胞自噬[20]，這提示天麻鉤藤飲可能也是通過調(diào)控Ca2+/AMPK/mTOR相關自噬信號通路而發(fā)揮降壓作用的。

綜上所述，天麻鉤藤飲對自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮細胞自噬相關信號通路Ca2+/AMPK/mTOR具有明顯的調(diào)控作用，其中藥整體降壓作用與調(diào)控自噬密切相關，推測天麻鉤藤飲通過降低ANGⅡ、IL-1等血管活性與炎癥介質(zhì)，然后抑制細胞內(nèi)鈣超載，繼而阻斷Ca2+/AMPK/mTOR自噬信號途徑，這可能是天麻鉤藤飲抑制血管內(nèi)皮細胞自噬發(fā)揮降壓作用的重要機制之一，但其具體機制仍有待明確，后續(xù)實驗計劃采用AMPK、mTOR受體阻斷劑與激動劑，并從藥物不同作用時間點對其進行更深層次的機制研究。