建昌黑山羊類固醇21-羥化酶基因部分序列的多態(tài)性研究

王慧宇，趙龍，范中濤，呂珽

（西昌學(xué)院，四川 西昌 615013）

建昌黑山羊廣泛分布于涼山彝族自治州，該品種山羊耐粗飼、易管理、抗病力強、生產(chǎn)性能較高，在當?shù)氐胤浇?jīng)濟發(fā)展中占有很重要的地位[1]。DNA分子標記是以個體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平遺傳變異的直接反映。在分子遺傳標記中，單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）技術(shù)是最常用的方法之一，主要用于檢測堿基突變[2]。類固醇21-羥化酶，是腎上腺類固醇激素合成調(diào)控的關(guān)鍵酶之一，由CYP21基因編碼，包含10個外顯子和9個內(nèi)含子。17-羥孕酮及孕酮在21-羥化酶的作用下，分別轉(zhuǎn)化成脫氧皮質(zhì)醇和脫氧皮質(zhì)酮，最終產(chǎn)物分別是去氧皮質(zhì)醇和去氧皮質(zhì)酮[3]。而17-羥孕酮、孕酮、皮質(zhì)醇等類固醇激素在調(diào)節(jié)動物的繁殖、生長及生命活動中具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 羊群來源及樣本采集 檢測羊群來自四川省會理縣建昌黑山羊種羊場，采集具有不同產(chǎn)羔數(shù)的母羊的血液樣本62份，記錄其生產(chǎn)數(shù)據(jù)。每只羊都從頸部靜脈采血5mL到真空采血管中，于實驗室-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 血液基因DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix（含染料）、Marker D2000、6×DNA Loading Buffer等生物制劑均購買自天根生化科技有限公司，30%Acr-Bis（29∶1）購買自 Biosharp 公司，其余是一些實驗室常規(guī)藥品。

1.3 DNA提取 血液樣品室溫下解凍，使用血液基因DNA提取試劑盒提取DNA。

1.4 引物設(shè)計與PCR擴增 根據(jù)CYP21基因DNA序列（GenBank登錄號：NC_007324），對 CYP21基因第八外顯子設(shè)計1對引物，目的片段大小為184bp，由杰李生物公司負責(zé)合成。

引物 1：CAGATTCAGCGCCGCCTTC；引物 2：ACT GCTAGGCCGCGTGGT。

PCR反應(yīng)體系：DNA模版3.0μL，引物1、引物2（10μM）各 1μL，2×預(yù)混液 13μL，雙蒸水補至 25μL，按照反應(yīng)體系加入反應(yīng)物混勻，按照PCR反應(yīng)循環(huán)進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)置：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸15s，共35個循環(huán)；然后72℃延伸7min，4℃保存。

1.5 SSCP分析 取4μL PCR 產(chǎn)物和6μL 6×DNA Loading Buffer試劑混勻，98℃變性10min，然后冰浴5min。變性后的PCR產(chǎn)物在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中常溫電泳12h，電泳結(jié)束后，銀染顯帶，用凝膠成像儀分析。

12%非變性聚丙烯酰胺配方：30%非變性聚丙烯酰胺 12 mL，5×TBE 6 mL，10%過硫酸銨 200 μL，TEMD 15μL，加 ddH2O 12mL。

1.6 多態(tài)性分析 根據(jù)電泳結(jié)果進行基因多態(tài)性分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增 使用1%濃度的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物特異性好，且符合目的條帶大小（186bp），條帶單一、明亮（見圖 1）。2.2 SSCP分析 對PCR產(chǎn)物進行12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，所有樣品的電泳圖像均顯示為三根條帶，無變化，不存在多態(tài)性樣本（如圖2所示）。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物圖

圖2 PCR產(chǎn)物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

3 討論

本次試驗結(jié)果表明，建昌黑山羊CYP21基因的第八外顯子基因序列不存在多態(tài)性，與其產(chǎn)羔數(shù)并無關(guān)聯(lián)。閆艷[4]研究表明：遼寧絨山羊、波爾山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、濟寧青山羊、安哥拉山羊5個山羊品種的CYP21基因第八外顯子均沒有多態(tài)性，與本試驗結(jié)果一致，說明這段基因序列在各個山羊品種中的保守性高。楊志敏等[5]的研究結(jié)果表明：小尾寒羊、特克塞爾羊、多賽特羊、湖羊4個綿羊品種的CYP21基因第八外顯子具有多態(tài)性。其原因可能是綿羊與山羊的CYP21基因本身就存在差別，綿羊CYP21基因第八外顯子的保守性低，易突變，而建昌黑山羊的CYP21基因第八外顯子具有高度保守性，出現(xiàn)基因突變的概率比較低所致；還可能是由于本次試驗樣本數(shù)量少，品種單一，未做不同品種間的比較所致。本試驗初步得出建昌黑山羊的CYP21基因第八外顯子不存在多態(tài)性，為以后建昌黑山羊的育種工作提供了借鑒。但建昌黑山羊CYP21基因的其余外顯子是否存在多態(tài)性以及多態(tài)性是否與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)，還需進一步研究。