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    云南維西縣百花蜜17種游離氨基酸的測(cè)定

    2018-08-17 05:32:32韓加敏陳夢(mèng)迪董霞劉意秋匡海鷗盧云飛褚衛(wèi)兵董坤
    中國(guó)蜂業(yè) 2018年8期
    關(guān)鍵詞:維西組氨酸苯丙氨酸

    韓加敏 陳夢(mèng)迪 董霞 劉意秋 匡海鷗 盧云飛 褚衛(wèi)兵 董坤

    (1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201;2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,昆明 650201;3 迪慶哈達(dá)谷蜂業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司,迪慶 674400)

    1 前言

    維西百花蜜是由東方蜜蜂采自高寒森林多種蜜源植物的花蜜與自身分泌物混合后,經(jīng)充分釀制而成的成熟蜂蜜。云南省迪慶藏族自治州維西傈僳族自治縣地處世界自然遺產(chǎn)“三江并流”腹地,地勢(shì)大起大落,由南往北呈階梯狀臺(tái)升,獨(dú)特的地理位置使其境內(nèi)蜜源植物極為豐富,所產(chǎn)蜂蜜源自野生蜜源,其中許多花卉是藥材之花,又出產(chǎn)在1800~3000m高原之上,故當(dāng)?shù)胤滢r(nóng)稱(chēng)之為藥材蜜或高原百花蜜[1]。維西百花蜜色澤呈琥珀色或深琥珀色,常溫時(shí)呈粘稠流體狀,有典型的自然花香氣息,口感濃厚、余味清香悠久,屬蜜中珍品。國(guó)家質(zhì)檢總局發(fā)布了2015年第44號(hào)公告,批準(zhǔn)維西百花蜜成為迪慶州第一個(gè)獲得國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)的產(chǎn)品。據(jù)統(tǒng)計(jì),截至2015年,維西縣養(yǎng)蜂戶已達(dá)3000余戶,蜂蜜產(chǎn)量約200t,成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的一個(gè)主渠道之一[2]。

    我國(guó)有100多種主要蜜源植物,蜂蜜種類(lèi)繁多,蜂蜜中氨基酸的主要來(lái)源是蜜源植物的花粉、花蜜及蜜蜂自身的分泌物,其種類(lèi)和含量受蜜源植物影響,也與地理環(huán)境和氣候等因素有關(guān)。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元,是人體所必需的一種物質(zhì),也是食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[3]。蛋白質(zhì)在人體中有著重要的生理功能,維持組織細(xì)胞的生長(zhǎng)、更新和修補(bǔ),為機(jī)體提供能量,還可以轉(zhuǎn)變?yōu)橐恍┥砘钚苑肿樱蠓肿尤缂に?、酶?lèi)、抗體等,小分子如兒茶酚胺類(lèi)激素、嘌呤、嘧啶和卟啉等,對(duì)動(dòng)物的代謝活動(dòng)發(fā)揮不可替代的作用。游離氨基酸是以游離狀態(tài)存在的一種小分子化合物,結(jié)構(gòu)上包含氨基和羧基。氨基酸可以分為蛋白質(zhì)氨基酸和非蛋白質(zhì)氨基酸兩大類(lèi)。當(dāng)體內(nèi)缺乏蛋白質(zhì)氨基酸時(shí),會(huì)導(dǎo)致組織器官代謝紊亂,引發(fā)一系列的相關(guān)疾病[3,4]。至少有8種氨基酸不能在人體中合成或合成量不足,得由食物來(lái)提供這一類(lèi)氨基酸,這就是所說(shuō)的必需氨基酸。所以,測(cè)定維西百花蜜的游離氨基酸對(duì)評(píng)價(jià)它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有重要作用。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)于單花蜜研究很多,但對(duì)于多花蜜中游離氨基酸的研究還比較少。本研究通過(guò)測(cè)定維西百花蜂蜜中的游離氨基酸,評(píng)價(jià)維西百花蜂蜜的質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及為百花蜂蜜的研究提供真實(shí)的科學(xué)依據(jù),為當(dāng)?shù)馗玫拈_(kāi)發(fā)蜂產(chǎn)品提供一定的幫助。

    2 材料與方法

    2.1 材料與試劑

    2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    維西苦味百花蜜(迪慶藏族自治州維西縣塔城鎮(zhèn),2015年9月采);維西甜味百花蜜(迪慶藏族自治州維西縣中路鄉(xiāng),2015年9月采)。

    2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

    甲醇、乙腈、蒸餾水、醋酸鈉、β-硫基乙醇、鄰苯二甲醛(OPA)、0.4mol/l pH 9.4的硼酸鹽緩沖液、17種氨基酸混標(biāo)(溶液)及17種氨基酸單標(biāo)(中國(guó)計(jì)量科學(xué)院)等。

    2.2 儀器與設(shè)備

    循環(huán)水式真空泵、抽濾瓶、超聲清洗儀、電子天平(AX223ZHE,常州奧豪斯儀器有限公司)、離心機(jī)(TDL奧豪斯儀,上海安亭科學(xué)儀器廠)、高效液相色譜儀(Agilent 1260 LC FLD-G1321B)、0.45濾膜(水系、有機(jī)系)、移液槍、pH計(jì)等。

    2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

    (1) 樣液制備:準(zhǔn)確稱(chēng)取蜜樣5g(精確到0.01g)于小燒杯中,用少量蒸餾水溶解,移至50ml容量瓶并定容,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    (2)流動(dòng)相配制:流動(dòng)相A:20mmol/l醋酸鈉pH=7.2,準(zhǔn)確稱(chēng)取1.64g醋酸鈉溶于1000ml蒸餾水中,用2%的醋酸調(diào)節(jié)pH至7.2,然后用真空泵抽濾,超聲振動(dòng)20min;流動(dòng)相B:甲醇∶乙腈∶pH=7.2的20mmol/l醋酸鈉=40∶40∶20,按上述比例混勻后用真空泵抽濾,超聲振動(dòng)20min。

    (3)OPA衍生試劑的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg OPA加入0.2ml甲醇溶液中,然后加入40μl β-硫基乙醇,最后加入2ml 0.4mol/l pH 9.4的硼酸鹽緩沖液,配好的試劑密封避光保存。

    (4)色譜條件:Agilent1260,F(xiàn)LD(G1321B);色譜柱:ZORBAX Eclipse AAA,Analytical 4.6×150nm 5-Micron;流動(dòng)相流速:1.4ml/min;進(jìn)樣量:7μl。

    (5)17種氨基酸混標(biāo)根據(jù)上述條件進(jìn)樣,測(cè)定17種氨基酸混樣色譜圖。17種氨基酸單標(biāo)配制成濃度和對(duì)應(yīng)的混標(biāo)濃度一致的溶液,然后根據(jù)上述色譜條件裝瓶上機(jī),分析出每種氨基酸的停留時(shí)間,確定17種混標(biāo)種每種氨基酸的位置。待測(cè)樣液用0.45μm濾膜過(guò)濾后裝瓶上機(jī),根據(jù)上述色譜條件檢測(cè)花蜜中氨基酸的種類(lèi),用外標(biāo)法計(jì)算每種氨基酸的含量。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果

    3.1.1 游離氨基酸混標(biāo)及蜜樣色譜圖

    17種氨基酸混標(biāo)(天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、色氨酸)及蜂蜜樣品的色譜圖如下圖1所示。

    圖1 17種氨基酸混標(biāo)及蜂蜜樣品色譜圖

    3.1.2 游離氨基酸的種類(lèi)及保留時(shí)間

    表1 蜂蜜樣品中游離氨基酸種類(lèi)、保留時(shí)間及含量

    2個(gè)維西百花蜜樣品的游離氨基酸的種類(lèi)、含量以及在測(cè)定過(guò)程中的保留時(shí)間如表1所示。實(shí)驗(yàn)中測(cè)得苦味百花蜜含有17種氨基酸,天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、脯氨酸、色氨酸,甜味百花蜜含有16種氨基酸,不含有蘇氨酸。這2個(gè)蜂蜜樣品中維西苦味百花蜜的總游離氨基酸含量較高,為960.58μg/g,維西甜味百花蜜總含量為708.89μg/g。2個(gè)蜜樣中含量最高的氨基酸均不相同,苦味百花蜜中組氨酸含量最高,為197.43μg/g,占游離氨基酸總含量的20.55%;甜味百花蜜中絲氨酸含量最高,為263.16μg/g,占游離氨基酸總含量的37.12%。所測(cè)得的游離氨基酸中含有人類(lèi)所需的所有必需氨基酸,蛋氨酸、色氨酸、賴(lài)氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸。

    3.1.3 百花蜜中含量差異較大的幾種游離氨基酸

    在維西東方蜜蜂百花蜜中,對(duì)4種含量較高的氨基酸,即谷氨酸、絲氨酸、組氨酸和苯丙氨酸來(lái)說(shuō),苦味百花蜜的組氨酸和苯丙氨酸含量較高,分別為197.43μg/g和171.47μg/g,而在甜味百花蜜中這2種氨基酸的含量很低,組氨酸幾乎是甜味百花蜜含量的10倍,苯丙氨酸是甜味百花蜜的7.5倍。谷氨酸雖然含量不突出,但也比甜味百花蜜高出近10倍。但是,在甜味百花蜜中絲氨酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于苦味百花蜜,也是此次所測(cè)得的游離氨基酸中含量最高的。

    3.1.4 百花蜜中含有的必需氨基酸及含量

    至少有8種氨基酸不能在人體中合成或合成量不足,得由食物來(lái)提供這一類(lèi)氨基酸,這就是所說(shuō)的必需氨基酸,維西百花蜜中含有這8種必需氨基酸。如圖3所示,苦味百花蜜中含有人類(lèi)所需的8種必需氨基酸,且7種氨基酸含量都普遍在20μg/g以上,尤其是苯丙氨酸,含量高達(dá)171.47μg/g。甜味百花蜜中含有7種必需氨基酸,不含蘇氨酸。而且,相對(duì)于苦味百花蜜來(lái)說(shuō),甜味百花蜜中的必需氨基酸的含量相對(duì)較低。

    圖2 蜂蜜樣品中含量差異較大的游離氨基酸

    圖3 蜂蜜樣品中含有的必需氨基酸及含量

    3.2 討論

    本研究采用液相色譜法測(cè)定游離氨基酸,在維西百花蜜中發(fā)現(xiàn)17種游離氨基酸存在;與趙成仕[5]等人所采用的酸水解-全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定蜂蜜中17種氨基酸相比,其所測(cè)的蜂蜜中色氨酸未測(cè),而維西百花蜜中丙氨酸未測(cè);在其研究中,含量比較高的是精氨酸、天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸和亮氨酸,而本研究中,含量較高的是谷氨酸、絲氨酸、組氨酸和苯丙氨酸。劉小力[6]測(cè)定了洋槐蜜、苜蓿蜜和棗花蜜中氨基酸組成及含量,其所測(cè)的3種蜂蜜均含丙氨酸,但不含色氨酸,含量較高的是天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸。由于以上研究所測(cè)含量均為百分比含量,與本研究所測(cè)的氨基酸不能做定量比較。周賢靖[7]等人用毛細(xì)管電泳-間接紫外檢測(cè)法測(cè)定單花蜜中的氨基酸僅9種,且5個(gè)樣品均未檢測(cè)到甲硫氨酸即蛋氨酸,在本研究中維西百花蜜所測(cè)得的蛋氨酸的含量分別為37.28μg/g和40.15μg/g;周賢靖所測(cè)的單花蜜和我們所測(cè)的維西百花蜜中的谷氨酸和絲氨酸含量均高,但其所測(cè)的單花蜜中脯氨酸、天冬氨酸含量較高,而維西百花蜜中組氨酸和苯丙氨酸含量較高。

    谷氨酸可以增強(qiáng)食品風(fēng)味;絲氨酸是一種非必需氨基酸,它在脂肪和脂肪酸的新陳代謝及肌肉的生長(zhǎng)中發(fā)揮著作用;在營(yíng)養(yǎng)學(xué)范疇里,組氨酸被認(rèn)為是一種人類(lèi)(主要是兒童)必需的氨基酸;苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一,在體內(nèi)大部分經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸,并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素,參與機(jī)體糖代謝和脂肪代謝[8];蘇氨酸是一種重要的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑,有緩解人體疲勞、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的效果。維西百花蜜中,含有人體所需的8種必需氨基酸,因此從氨基酸方面來(lái)看,該地區(qū)蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,且苦味百花蜜優(yōu)于甜味百花蜜。盡管2種維西百花蜜的氨基酸組成及含量存在差異,但對(duì)苦味蜂蜜的形成機(jī)制尚不清楚。

    4 結(jié)論

    維西縣甜味和苦味百花蜜均含有以下16種游離氨基酸,分別為天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、色氨酸,其中苦味百花蜜除此之外還含有蘇氨酸。在維西東方蜜蜂百花蜜中,4種含量較高的氨基酸分別是谷氨酸、絲氨酸、組氨酸和苯丙氨酸;在維西苦味蜜中,組氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸含量較高。必需氨基酸是人體自身不能合成的一類(lèi)氨基酸,維西百花蜜含有人體所需的全部必需氨基酸,說(shuō)明該地區(qū)蜂蜜在氨基酸方面的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

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