煙草專用液體肥添加黃腐酸對烤煙西柏三烯二醇代謝水平的影響

席奇亮，楊鐵釗*，周 方，王 冬，葉紅朝，徐世曉，楊丙釗

（1 河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州 450002；2 河南中煙工業(yè)公司技術中心，鄭州 450002；3 河南省洛陽市煙草公司，洛陽 471000）

煙草葉面腺毛豐富且具有較強的分泌能力[1]，其分泌物與煙草的香味有密切的關系，是煙草香味和香氣組分的重要前體物，某些品種葉面分泌物可占煙葉干重的10%[2]。西柏三烯二醇是烤煙葉面腺毛分泌物的主要成分，占到腺毛分泌物總量的40%～80%[3]。已有研究表明，西柏三烯二醇是烤煙香味成分的重要前提物質，經(jīng)一定的降解過程可形成以茄酮為主要代表物的多種致香成分[4]，而茄酮作為烤煙中含量最豐富的的中性香味物質之一，本身具有很好的香氣，對改善煙草的香味也有很重要的作用[5]。諸多因素對烤煙西柏三烯二醇的代謝都有影響，趙華新等[6]研究了不同海拔高度對烤煙西柏三烯二醇含量的影響，指出較低的海拔高度更易于積累西柏三烯二醇；翁夢玲等[7]對遮陰條件下及正常光照條件下煙草葉面腺毛密度及西柏三烯二醇含量進行了比較，結果表明遮陰處理的煙葉腺毛密度和西柏三烯二醇含量明顯低于正常光照處理，說明光照對葉面腺毛的分泌活動有著顯著的影響；孔光輝等[8]的研究表明施用有機肥料能顯著提高葉片腺毛密度，西柏三烯二醇含量顯著高于施用無機肥料。

黃腐酸是腐殖酸中分子量較小的高分子有機化合物，含有多種活性官能團，易被植物吸收，具有較強的生物活性[9]，已在多種作物上應用并取得了很好的效果。陳玉玲等[10]在含有黃腐酸的營養(yǎng)液中培養(yǎng)小麥幼苗并測定其IAA和ABA兩種激素的水平，發(fā)現(xiàn)黃腐酸能顯著提升IAA和ABA的水平，并指出這與黃腐酸能刺激植物生長、抑制氣孔開啟是一致的，說明黃腐酸既能直接對植物起作用，也能通過改變內源激素水平間接起作用。回振龍等[11]研究了黃腐酸對連作馬鈴薯幼苗生長發(fā)育、塊莖營養(yǎng)和抗性生理的影響，結果表明黃腐酸能顯著促進連作馬鈴薯的生長發(fā)育，提高馬鈴薯塊莖的淀粉含量、Vc含量和可溶性蛋白含量，增強連作馬鈴薯的抗逆能力。張亞飛等[12]研究指出化肥和黃腐酸配施能顯著減少氨揮發(fā)，增加土壤氮肥殘留，提高根系活力并增加根系生物量，從而提高氮肥利用率，有利于桃樹新梢生長和樹勢健壯。黃腐酸類物質 (黃腐酸鉀) 在煙草種植方面的應用已有研究，劉國順等[13]研究了在基肥中配施黃腐酸鉀對烤煙質體色素和碳氮代謝及品質的影響，發(fā)現(xiàn)該施用方法能提高煙葉生育前期質體色素含量和碳氮代謝水平，而且能夠促進煙葉質體色素適時降解和碳氮代謝的協(xié)調，有利于優(yōu)質煙葉的形成。趙永長等[14]采用水培的方法研究了葉面噴施黃腐酸鉀對烤煙幼苗生長和光合熒光特性的影響，結果表明噴施黃腐酸鉀能改善滲透脅迫下烤煙幼苗的生長，減緩凈光合速率 (Pn) 和蒸騰速率 (Tr)的下降，同時減輕脅迫對烤煙葉片光系統(tǒng)II (PSII) 的傷害，提高光化學效率。

目前，關于西柏三烯二醇代謝的研究多注重對現(xiàn)象的分析，深入到分子水平對葉面分泌物代謝過程中的關鍵基因進行分析的研究還不多見，至于黃腐酸對煙草次生代謝的影響更是鮮有報道。本研究從利用水肥一體化技術改良烤煙葉面分泌物入手，通過對比各處理烤煙西柏三烯二醇代謝關鍵基因CYC-1、CYP71D16以及DXS和DXR的表達情況，并結合對葉面腺毛密度及感官評價結果的分析，初步闡明了新型含黃腐酸煙草專用液體肥料提高烤煙葉面分泌物含量 (尤其是西柏三烯二醇含量) 的原因，以期為在煙葉生產(chǎn)中推廣使用水肥一體化技術和含黃腐酸新型煙草專用液體套餐肥來改良烤煙葉面分泌物提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2015—2016年進行了2年的田間試驗和1年的盆栽試驗，供試品種均為豫煙6號。2年田間試驗均安排在洛陽市宜陽縣鹽鎮(zhèn)鄉(xiāng)張村 (34°38′N，111°58′E) 進行；盆栽試驗于 2016 年安排在鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學毛莊科教園區(qū) (34°51′N，113°35′E) 進行。兩個區(qū)域均位于華北平原南部，屬北溫帶大陸性季風氣候。田間試驗所在地洛陽市宜陽縣2015年和2016年平均氣溫分別為15.2℃和14.9℃，年降水量分別為702.3 mm和670.5 mm。前茬作物為烤煙。土壤的基礎肥力指標分別為：pH值為7.91、有機質含量 12.2 g/kg、堿解氮 82.03 mg/kg、有效磷 (P2O5)含量 13.62 mg/kg、有效鉀 (K2O) 含量 185.8 mg/kg。盆栽試驗所在地鄭州市2016年平均氣溫為15.5℃，年降水量為640.7 mm。盆栽試驗供試土壤由田間試驗所在地提供。

1.2 試驗設計

田間試驗和盆栽試驗均設置3個處理，即常規(guī)栽培處理 (用FP表示)、水肥一體化施用普通煙草專用液體肥 (用DF1表示) 和水肥一體化施用含黃腐酸煙草專用液體肥 (用DF2表示)。田間試驗采用小區(qū)對比試驗設計，各處理小區(qū)面積均為667 m2，行株距為 1.1 m × 0.55 m，另設保護行，每個小區(qū)種植1000株，每個處理重復3次；盆栽試驗用土風干后過40目篩子，盆高30 cm，直徑35 cm，每盆裝土20 kg，每個處理種10盆，周圍擺放保護盆，以消除邊行優(yōu)勢。田間試驗和盆栽試驗各處理除施肥方案不同外，其他栽培措施按優(yōu)質煙生產(chǎn)技術規(guī)范進行。

田間試驗3個處理具體施肥方案如下：FP處理在大田起壟時條施芝麻餅肥 (含氮量4%) 225 kg/hm2、過磷酸鈣 [Ca(H2PO4)2·H2O] 150 kg/hm2、煙草專用復合肥 (15–15–15) 225 kg/hm2作基肥，硝酸鉀 (KNO3) 用量 75 kg/hm2，作為追肥在團棵期一次穴施，硫酸鉀 (K2SO4) 用量 300 kg/hm2，在煙株圓頂后分3次穴施，煙株全生育期總施氮量為52.5 kg/hm2；DF1處理在大田起壟時僅條施芝麻餅肥 (含氮量4%)375 kg/hm2作基肥，追肥采用本課題組研制的煙草專用液體套餐肥 (不含黃腐酸)，其中包括煙草專用還苗生根肥 (肥料品級 20–10–10) 75 kg/hm2，旺長肥(肥料品級 15–5–10) 150 kg/hm2，成熟落黃肥 (肥料品級 0–0–40) 150 kg/hm2，通過水肥一體化滴灌系統(tǒng)根據(jù)煙株需肥需水規(guī)律分6次施入，煙株全生育期總施氮量與常規(guī)栽培處理保持一致。DF2處理基肥同DF1處理，追肥采用本課題組研制的新型含黃腐酸煙草專用液體套餐肥，該套餐肥各類型肥料基礎配方與DF1處理相同，但均添加黃腐酸，黃腐酸含量≥20.0%，其余與DF1處理保持一致。盆栽試驗施肥方案與田間試驗基本相同，所施肥料用量和灌水量均按照田間試驗用量進行換算，保持一致。

田間試驗水源由當?shù)責熕涮坠こ绦藿ǖ?00 m3蓄水池提供，盆栽試驗水源由河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)水井提供，施肥灌溉首部系統(tǒng)均采用移動式施肥灌溉一體機 (由汽油機水泵、過濾器、施肥桶、空氣閥等部件構成)，管網(wǎng)系統(tǒng)由主管道 (PE材質，直徑63 mm) 連接貼片式滴管帶 (PE 材質，直徑 16 mm，滴頭間距 30 cm，滴頭流量 2.5～3 L/h) 組成。

1.3 樣品的采集與測定

1.3.1 樣品的采集 盆栽試驗選定各處理具有代表性的煙株，自下而上掛牌標記1～22位可收葉，并記錄各處理第13、14葉位葉片的葉齡 (葉片生長至2～3 cm長度時開始計算葉齡)。在葉齡60 d時取樣2 片，樣品遮光干冰保存運送到實驗室進行葉面腺毛密度觀察、RNA提取和葉面分泌物的提?。惶镩g試驗取各處理葉齡60 d的中部鮮煙葉進行調制并測其茄酮含量，待煙葉成熟采烤后取各處理具代表性等級 (C3F) 烤后煙葉，測定茄酮含量和進行感官質量評價。

1.3.2 葉片腺毛密度觀察 于各處理煙株中部葉片(第14葉位) 葉齡60 d時采取新鮮葉片，沿其主脈兩側切取約 10 mm × 10 mm 的平整小塊葉片，使用捷克TESCAN公司的VEGA 3 LM掃描電子顯微鏡進行觀察和拍照，連續(xù)拍攝并統(tǒng)計3個視野中的腺毛數(shù)，這3個觀察值平均數(shù)代表每個樣品的腺毛密度值。該電鏡采用氣體二次電子成像，工作電壓15 KV，工作距離11 mm，樣品室和鏡筒狀態(tài)選用高真空 (10–3Pa)。

1.3.3 葉面腺毛分泌物的提取與測定

1.3.3.1 葉面分泌物的提取與濃縮 在葉齡 60 d 時取各處理煙株第14葉位葉片，將1000 mL二氯甲烷倒入金屬托盤 (清潔無水殘留) 中，用鑷子夾住葉柄基部將葉片整片浸入二氯甲烷溶液中2秒鐘，將葉片提出溶液2秒，使葉片上的二氯甲烷滴回到盤中，這樣為完成浸提一次，每片葉片反復浸提4次，最后1次浸提后需要將葉片上的二氯甲烷完全滴回盤中。

將托盤中所有的二氯甲烷轉移到2000 mL的燒杯中，向燒杯中加入1 mL的內標 (內標為1.01 g蔗糖八乙酸酯和 1.271 g 正–17–烷醇，定容 500 mL)，充分混勻，加入10 g左右無水硫酸鈉，充分攪拌吸去水分，用定量濾紙過濾至1000 mL圓底燒瓶中，濾液減壓旋轉蒸發(fā)至20 mL左右，最后定容至50 mL容量瓶。用移液管取5 mL上述浸提液于色譜瓶中，在氮氣保護下將溶劑吹干。加入500 μL 1∶1(v∶v) DMF∶BSTFA，在75℃水浴中進行衍生化反應60 min，加入0.5 mL的二氯甲烷溶解不溶物，即為GC/MS分析樣品液。

1.3.3.2 葉面分泌物的測定 采用美國 Thermo Fisher Scientific公司的 TRAVE GC ULTRA-DSQ ⅡMS 型氣相色譜–質譜 (GC–MS) 聯(lián)用儀進行定性定量測定。

氣相色譜–質譜聯(lián)用儀反應條件：GC條件，色譜柱 DB-5MSUI石英毛細管柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度 250℃；程序升溫，40℃ 保持2 min，然后以 6℃/min 升溫至 180℃ 保持 2 min，以2℃/min升溫至280℃保持 20 min；載氣為高純氦氣，載氣流速為恒流 0.8 mL/min；進樣量 1.0 μL，分流比15∶1；MS條件為傳輸線溫度 250℃；EI離子源溫度 280℃；電離能量 70 eV；質量數(shù)范圍50～650 amu；檢索譜庫 NIST11。1.3.4 葉片腺毛相關基因表達分析

1.3.4.1 葉片總 RNA 的提取 使用 TaKaRa 公司生產(chǎn)的RNAiso Reagent試劑盒，并按照說明書提供的方法提取參試材料葉片的總RNA。

將提取的RNA溶于適量的DEPC水中，采用紫外分光光度計分別測定260 nm和280 nm分光率并計算二者比值，以判斷提取RNA的純度和濃度；然后進行2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性；RNA樣品–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 熒光定量 PCR 以煙草 Actin 基因 (Genebank Accession No.AB158612) 為內參，引物序列為 Actin-F: 5′-GCTGTTTTTCCTAGTATTGTTGGTC-3′，Actin-R: 5′-AATACCTGTTGTACGGCCACTG-3′；CYC-1 (Genebank Accession No.AY049090) 引物為 F:5′-CGAGGGTGGGATCAAGGAAATACA-3 ′，R: 5′-ATCGCATCCGTGAAAAGCATAAG-3′；CYP17D16(GenBank Accession No.AF166332) 引物為 F: 5′-ATGGACCAATTATGCACCTTCAACT-3′，R: 5′-GGCACTGAGCAATTCCAAGAGACA-3′；DXS(GenBank Accession No.EU650419) 引物為 F: 5′-GCCGAGAGAGCTGCAGACAAGTAT-3′，R: 5′-TTGGGAAGCGACGGTGGAATA-3′；DXR(GenBank Accession No.DQ839130) 引物為 F: 5′-TCGCTGAGAATCCGGACAAGTTTA-3′，R: 5′-TGCGCAACCAACTATTCCTGTAAC-3′。

熒光定量 PCR 反應體系為 20 μL：10 μL SYBR Green qPCR Mix，0.4 μL Forward Primer (10 μmol/L)，0.4 μL Reverse Primer (10 μmol/L)，0.4 μL ROX，cDNA 1 μL，水 7.8 μL。PCR 擴增程序為：95℃ 預變性 10 min；95℃ 模板變性 15 s，55℃ 引物和模板充分退火 15 s，72℃ 延伸 45 s，共循環(huán)40次，分離后4℃保存。

1.3.5 烤后煙葉茄酮含量的測定 使用同時蒸餾萃取裝置，以二氯甲烷作為萃取劑，裝置的一端接1000 mL平底燒瓶，內盛20.0 g煙樣及350 mL蒸餾水，加熱。裝置的另一端接100 mL燒瓶內盛40 mL二氯甲烷，此處在水浴鍋內加熱，水浴溫度為60℃，蒸餾萃取同時進行2 h，完成之后，向二氯甲烷萃取液中加入10 g左右無水硫酸鈉吸取水分，然后冷卻干燥，最后直至把二氯甲烷萃取液濃縮至1 mL，并以乙酸苯乙酯為內標，做定量分析。

采用美國HP5890Ⅱ-5972氣質聯(lián)用儀對煙葉樣品進行定性定量分析。GC/MS分析條件：色譜柱，hp-5 (60 m × 0.25 mm.i.d.× 0.25 μm d.f.)；載氣及流速為He 0.8 mL/min；進樣口溫度250℃；傳輸線溫度280℃；離子源溫度177℃；升溫程序為初溫50℃，恒溫 5 min 后以 5℃/min 升至 120℃，保持 5 min，再以5℃/min升至180℃，保持5 min，再以6℃/min升至250℃，保持15 min；分流比為1∶15；進樣量2 μL；電離電壓70 ev；電離方式EI；質量數(shù)范圍50～500 amu。MS 譜庫：NIST11。

1.3.6 單料煙感官質量評價 將樣品煙葉進行切絲卷制單料煙，卷煙感官評吸鑒定聘請河南中煙有限責任公司5位評吸專家按香氣質、香氣量、濃度、柔細度、余味、雜氣、刺激性等方面進行評價。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)采用Excel2013進行整理，采用Sigmaplot12.5軟件進行圖表繪制。采用Prizm4統(tǒng)計分析軟件進行熒光定量PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用的方法對基因的相對表達量進行檢測。

2 結果與分析

2.1 煙株葉片葉面腺毛密度差異分析

煙草的腺毛根據(jù)腺毛柄情況可分為長柄、短柄和分枝腺毛[15]。一般認為，長柄腺毛數(shù)量較多，具有較強的分泌能力，短柄腺毛數(shù)量較少，分泌能力較弱，分枝腺毛一般出現(xiàn)在葉脈和煙莖上，數(shù)量最少[16]。通過盆栽試驗，對各處理中部葉齡60 d葉片的腺毛密度進行電鏡掃描觀察并進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，腺毛在各處理烤煙葉片上的分布密度存在明顯的差異 (圖1)。從圖1-Ⅳ可以看出，DF2處理腺毛總密度最高，達到10.7根/mm2，且具有較強分泌能力的長柄腺毛數(shù)量也最多，達到8.6根/mm2，體型也較大 (圖1-Ⅲ)，而FP和DF1處理腺毛總密度較低，分別為8.5根/mm2和7.6根/mm2，尤其是長柄腺毛的數(shù)量明顯低于DF2處理，分別為5.8根/mm2和6.2根/mm2，體型也較小 (圖1-Ⅰ和圖1-Ⅱ)。可見，施用含黃腐酸液體肥料可以提高煙葉的腺毛密度，明顯增加長柄腺毛的數(shù)量。

2.2 煙株葉片葉面腺毛分泌物總量及組分差異分析

煙葉葉片分泌物在葉齡60 d時各組分含量差異最明顯[17]，對葉齡60 d時中部葉的葉面分泌物進行分析 (表1) 可以看出，在3個處理中，DF2處理西柏三烯二醇含量占總含量的75.61%，為各處理中最高，F(xiàn)P處理次之，為70.56%，DF1處理最低，為67.13%?？梢姡靼厝┒紴楦魈幚砣~片葉面腺毛分泌物的主要成分，這也決定了其在煙葉香味形成的過程中起著決定性的作用。就葉面腺毛分泌物總量而言，DF2處理具有最高的分泌量，F(xiàn)P處理次之，DF1處理最低，西柏三烯二醇的含量也具有相同規(guī)律，DF2處理西柏三烯二醇達到65.43 μg/cm2，為各處理最高，明顯高于 FP 處理 (46.84 μg/cm2) 和DF1處理 (39.8 μg/cm2)，這說明施用含黃腐酸液體肥料能明顯提高煙草葉面分泌物的含量，尤其是西柏三烯二醇的含量。

2.3 西柏三烯二醇代謝相關基因相對表達量差異分析

圖1 葉齡60 d時各處理葉片的腺毛形態(tài)及密度 (盆栽試驗)Fig.1 Trichome morphology and density at the leaf age of 60 d (Pot experiment)[注（Note）：Ⅰ，F(xiàn)P 處理葉面腺毛形態(tài) Leaf trichome morphology of FP treatment；Ⅱ，DF1 處理葉面腺毛形態(tài) Leaf trichome morphology of DF1 treatment；Ⅲ，DF2 處理葉面腺毛形態(tài) Leaf trichome morphology of DF2 treatment；Ⅳ，各處理葉面腺毛密度差異統(tǒng)計 Statistical analysis of leaf trichome density.]

表1 各處理烤煙中部葉葉齡60 d葉面分泌物組分含量 (μg/cm2，盆栽試驗)Table1 GC-MS analysis of the trichome exudates components at the leaf age of 60 days (Pot experiment)

已有研究表明，煙葉的西柏三烯二醇代謝受CYC-1、CYP71D16、DXR、DXS等基因的調控[18]。對各處理葉齡60 d的中部葉進行熒光定量PCR測定(圖2) 可以看出，黃腐酸能顯著提高煙葉CYC-1、CYP71D16、DXR、DXS基因的表達量。DF2處理上述4個基因的相對表達量均顯著高于FP和DF1處理，其中，CYC-1的相對表達量分別是FP和DF1處理的12.45倍和4.11倍，CYP71D16的相對表達量分別是FP和DF1處理的3.54倍和5.71倍，DXR的相對表達量分別是FP和DF1處理的3.22倍和2.44倍，DXS的相對表達量分別是FP和DF1處理的3.44倍和2.28倍。前面的分析已經(jīng)揭示含黃腐酸液體肥料能使煙葉的腺毛密度和葉面分泌物的主要成分西柏三烯二醇的含量得到大幅提升，與煙葉西柏三烯二醇代謝密切相關的基因顯著地上調表達則可以很好地解釋這一現(xiàn)象，這也再一次證明西柏三烯二醇的代謝與CYC-1、CYP71D16、DXR、DXS基因密切相關，同時，也證實了黃腐酸可以通過使相關基因的上調表達顯著增加煙葉西柏三烯二醇的含量。

2.4 西柏三烯二醇主要降解產(chǎn)物茄酮含量差異分析

茄酮是目前學界公認的西柏三烯二醇主要降解產(chǎn)物[19]，是煙草中含量最豐富的的中性香味物質之一，本身具有很好的香氣，對改善煙草的香味也有很重要的作用[5]。對2015—2016年連續(xù)2年田間試驗各處理葉齡60 d和調制后的中部煙葉茄酮含量進行測定，取2年數(shù)據(jù)的均值（圖3），可以看出不同處理西柏三烯二醇的降解存在明顯的差異，葉齡60 d時各處理茄酮含量差異不明顯，而調制后DF2處理的初烤煙葉茄酮含量明顯高于其他處理，可達到112.27 μg/g，分別是FP和DF1處理的2.93倍和1.99倍，這進一步驗證了前述的結果，說明施用含黃腐酸的液體肥料能明顯提高西柏三烯二醇的降解能力，其煙葉中較高含量的西柏三烯二醇經(jīng)調制過程降解為對煙葉香氣有巨大貢獻的茄酮，從而使初烤煙葉茄酮含量明顯提升。

2.5 各處理初烤煙葉感官質量評價分析

煙葉的感官質量是卷煙產(chǎn)品質量的重要組成部分，是煙葉質量的核心和基礎[20]。委托河南中煙工業(yè)有限公司評吸專家連續(xù)2年對田間試驗中部初烤樣品煙進行感官質量評價 (表2)。由表2可以看出，DF2處理連續(xù)2年中部葉感官質量評價得分均為各處理最高，DF1處理2015年感官評價結果略低于FP處理，2016年則要高于FP處理。其中DF2處理香氣質較好，香氣量較足，濃度較足，煙氣細膩且余味較舒適，雜氣和刺激性較小，無明顯缺點。相比之下，F(xiàn)P和DF1處理稍顯遜色，主要表現(xiàn)在香氣質略顯平淡，香氣量較少，煙氣濃度不足，雜氣和刺激性較重。這說明茄酮對煙葉香氣的改善有著重要貢獻，施用含黃腐酸的液體肥料能顯著增加煙葉中的茄酮含量，提升煙葉的抽吸品質。

圖2 盆栽試驗葉齡60 d時各處理CYC1、CYP71D16、DXR和DXS基因的相對表達量Fig.2 Relative expressions of CYC-1, CYP71D16, DXR and DXS at the leaf age of 60 days in pot experiment[注（Note）：FP—常規(guī)栽培處理 Conventional fertilizer,basal applied in soil; DF1—煙草專用液體肥,隨水灌溉 Liquid fertilizer for tobacco,applied with irrigation; DF2—含黃腐酸煙草專用液體肥 Liquid fertilizer containing fulvic acid for tobacco,applied with irrigation.]

圖3 各處理中部煙葉葉齡60 d和調制后茄酮的含量(2年田間試驗均值)Fig.3 The content of solanone at leaf age of 60 days andafter flue-cured (Mean of two years for field experiment)[注（Note）：FP—常規(guī)栽培處理 Conventional fertilizer,basal applied in soil; DF1—煙草專用液體肥,隨水灌溉 Liquid fertilizer for tobacco,applied with irrigation; DF2—含黃腐酸煙草專用液體肥 Liquid fertilizer containing fulvic acid for tobacco,applied with irrigation.]

3 討論

3.1 對烤煙葉面腺毛密度及腺毛分泌物的影響

大量研究表明，煙草腺毛的發(fā)育過程和代謝活動是同步進行的[21]。楊鐵釗等[22]研究指出煙葉生長過程中單位面積葉面的分泌物量呈雙峰曲線變化態(tài)勢，中部位葉面分泌物量在葉齡60 d時達到最大值，之后直至煙葉成熟，腺毛分泌物含量呈逐漸下降趨勢。因此，本研究選取中部葉葉齡60 d進行葉面腺毛密度和分泌物的測定，這是最佳的時期。煙草的腺毛根據(jù)腺毛柄情況可分為長柄、短柄和分枝腺毛。就數(shù)量而言，長柄腺毛是煙葉腺毛的主要類型，這與本研究結果相一致；就分泌能力而言，分枝腺毛的分泌能力最強，但數(shù)量較少。關于作物葉片腺毛密度與其分泌物含量的關系，目前的研究尚未能形成一致意見，陳淑珍等[23]認為腺毛密度與整葉分泌物量正相關，時向東等[24]研究認為對煙葉香氣品質作用最大的為長柄腺毛，長柄腺毛越多，葉面腺毛分泌物量越大，與腺毛密度的關系不大，而Nielsen等[25]綜合分析了多個品系煙草腺毛密度與其分泌量的關系，認為在煙草中一些腺毛密度很小的品系，其腺毛分泌物的含量與腺毛密度呈正相關，而腺毛密

表2 田間試驗各處理中部初烤煙葉感官質量評分 (n = 9)Table2 Scores of sensory quality of modulated flue-cured tobacco leaves in field experiment

度大的品系，其腺毛分泌物的含量可能更多地取決于腺毛的分泌能力，而與腺毛密度關系不大。根據(jù)本研究結果可以看出DF1處理單位面積葉片的長柄腺毛數(shù)量高于FP處理，但是葉面腺毛的分泌量卻低于FP處理；本研究結果還表明葉面腺毛的分泌量與葉面腺毛密度呈正相關，腺毛密度越大腺毛的分泌量越大，因此作者認為腺毛分泌量受多種因素的影響，而腺毛密度很可能是主要的影響因素。本試驗中DF1和DF2處理均在水肥一體化條件下滴施液體肥料，但是DF1處理腺毛密度低、分泌量少，這很可能是因為DF1處理在水肥一體化條件下施用液體肥料，肥料利用率高，煙株田間長勢較旺，葉片開片較好，葉面積較大。DF2處理同樣在水肥一體化條件下施用液體肥料，卻因為黃腐酸具有較強的生物活性，能夠刺激植物表皮毛的形成[26]，從而使葉片在葉面積增加的情況下依然保持較高的腺毛密度。

3.2 對西柏三烯二醇合成代謝相關基因表達的影響

關于西柏三烯二醇代謝的基因調控過程前人已有研究，目前已經(jīng)明確CYC-1和CYP71D16這2個基因直接參與了西柏三烯二醇的合成[27]。其中，

CYC-1是編碼西柏三烯醇合成酶的基因，西柏三烯醇合成酶以香葉基香葉基焦磷酸為底物催化合成西柏三烯一醇[28]，而作為編碼細胞色素P450加氧酶的基因，CYP71D16主要參與調控了西柏三烯一醇向西柏三烯二醇轉變的過程[29]，可見，CYC-1和CYP71D16

直接決定著植物腺毛分泌物中西柏三烯一醇和西柏三烯二醇的含量，在類西柏烷二萜合成中發(fā)揮著重要的作用。本試驗除了對上述2個基因進行了研究，還對與西柏三烯二醇合成密切相關的另外2個基因DXS和DXR進行了研究。DXS是編碼脫氧木酮糖磷酸代謝途徑第一個限速酶脫氧木酮糖–5–磷酸合成酶的基因，該酶的作用是催化糖酵解產(chǎn)物丙酮酸和3–磷酸甘油醛形成脫氧木酮糖–5–磷酸[30]，由于脫氧木酮糖–5–磷酸也是維生素B1和B6的前體物[31]，所以催化脫氧木酮糖–5–磷酸形成甲基赤鮮糖醇–4–磷酸的脫氧磷酸木酮糖還原異構酶 (DXR)，被認為是脫氧木酮糖磷酸代謝途徑中的另一個更為重要的關鍵酶。一般認為，香葉基香葉基焦磷酸是合成西柏三烯二醇的底物，在植物中以香葉基香葉基焦磷酸為底物發(fā)生環(huán)化作用形成的二萜還有順–冷杉醇和賴百當二萜，但香葉基香葉基焦磷酸環(huán)化作用的具體走向以及所占比例如何，一方面取決于CYC-1和CYP71D16基因的調控作用，另一方面則由底物香葉基香葉基焦磷酸的豐富程度決定[32]，DXR和DXS基因的過表達為下游限速酶提供了充足的底物，保障GGPP環(huán)化作用向合成西柏三烯二醇的方向發(fā)生，因此，本研究認為黃腐酸促進DXR和DXS基因上調表達可能對西柏三烯二醇的合成具有更大貢獻。為了探究不同處理對西柏三烯二醇代謝在分子水平上的差異，本試驗測定了不同處理上述4個基因的表達量，結果表明DF2處理CYC-1、CYP71D16、DXR和DXS的基因相對表達量均明顯高于其余處理，究其原因DF1處理和DF2處理均采用水肥一體化滴施液體肥料，且二者肥料配方基本相同，區(qū)別僅在于DF2處理施用的液體肥料含有黃腐酸，可見黃腐酸是西柏三烯二醇代謝相關基因上調表達的主要原因。前人的研究已經(jīng)證實黃腐酸能調控某些基因的表達量，于學建[33]研究了黃腐酸調控甜菊糖苷合成的機理，結果發(fā)現(xiàn)黃腐酸可以顯著提高甜葉菊葉片中UGT基因的表達并使其在甜葉菊生長過程中維持較高的表達水平。許原原[34]研究了黃腐酸對苜蓿根瘤固氮菌S.meliloti群體感應系統(tǒng)的調控機理，結果表明黃腐酸可以顯著抑制S.meliloti8530群體感應相關基因expR、sinI、sinR的表達。Schmidt等研究發(fā)現(xiàn)黃腐酸顯著下調了控制根毛生長的負調控基因WEREWOLF和GLABRA2的表達，從而提高了擬南芥根毛的長度及密度。本研究結果也表明施用含黃腐酸的液體肥料能夠明顯使CYC-1、CYP71D16、DXR和DXS基因上調表達，使煙葉腺毛大量分泌西柏三烯二醇，進而提高初烤煙葉的茄酮含量，改善煙葉的抽吸品質。關于黃腐酸調控基因表達的原因可能是多樣的，F(xiàn)ialova[35]對比了小麥培養(yǎng)在水中和含有黃腐酸營養(yǎng)液中時根中RNA的含量，發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)在含有黃腐酸營養(yǎng)液中時根中RNA含量 (60 μg/株)明顯高于在水中培養(yǎng) (25 μg/株)，且下降十分緩慢，通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，黃腐酸對RNA合成的影響是不均衡的，核糖體RNA受影響最大。Wang等[36]用14C標記的黃腐酸進行實驗，結果表明水稻細胞能利用黃腐酸的降解物來合成蛋白質和DNA。還有人研究發(fā)現(xiàn)黃腐酸能使洋蔥分生組織間期細胞核體積增大，3H標記的胸苷實驗證明DNA合成增加，3H標記的尿苷實驗證明相應的mRNA增加[37]。以上研究可以為解釋黃腐酸參與基因調控提供一些思路，黃腐酸很可能是參與了DNA的合成、轉錄以及翻譯的過程，從而完成其調控過程，影響蛋白質的合成。

3.3 對西柏三烯二醇生物降解的影響

業(yè)已證明，大多數(shù)西柏烯類物質都來源于西柏三烯二醇的生物降解[5]，而關于其生物降解途徑國內外的研究鮮有報道，一般認為西柏三烯二醇的降解主要有兩種模式[38]，一種是在氧化劑的作用下進行，另一種是在酶的催化作用下進行，如在脂肪氧化酶的作用下完成。起始氧化完成之后經(jīng)過脫水、酸堿重排和消除反應后，西柏三烯二醇可轉化為C8～C18不同碳原子數(shù)的香味物質，其中主要以C13的茄酮為主。本研究連續(xù)2年對比了3個處理葉齡60 d和調制后初烤煙葉茄酮含量的差異，在葉齡60 d時3個處理茄酮含量差異不明顯，而調制后的初烤煙葉DF2處理的茄酮含量卻顯著高于FP和DF1處理，這很可能是因為在煙葉成熟和調制的過程中黃腐酸及其降解物質參與了西柏三烯二醇的降解并促進了該過程。黃腐酸調節(jié)植物生長代謝的作用機理比較復雜，根據(jù)已有研究可以明確的是[39]，在酚–醌氧化還原體系中黃腐酸既是氧的活化劑，又是氫的載體，直接參與了和呼吸作用有關的電子傳遞，提高了植物體內的氧化還原能力，影響植物的呼吸作用、細胞膜透性和滲透壓，以及多種與氧化還原反應有關的酶的活性，從而完成對植物生長代謝的調控，其對西柏三烯二醇降解的影響很可能就是通過增強氧化劑的氧化能力或者提高酶的活性來完成的。目前公認的西柏三烯二醇主要降解產(chǎn)物是茄酮，是煙草中含量最豐富的中性香味物質之一，本身具有很好的香氣，對改善煙草的香味也有很重要的作用[5]。茄酮的轉化產(chǎn)物如茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮也是重要的煙草香味物質，茄酮的氧雜雙環(huán)化合物具有特別的香味，對于改善煙草的香味和提升抽吸品質也有重要的貢獻[40]，本研究的感官質量評價結果也證實了這一點。

4 結論

本研究初步闡明了黃腐酸調控烤煙西柏三烯二醇代謝的機理，試驗所用的新型黃腐酸煙草專用液體套餐肥含有的有機和無機養(yǎng)分，在合理組配的條件下能夠充分發(fā)揮黃腐酸的生物活性，通過促進西柏三烯二醇代謝相關基因CYC-1、CYP71D16、DXR和DXS的表達，尤其是DXR和DXS的表達，進而提升葉面腺毛密度和分泌量，提高葉面分泌物中西柏三烯二醇的含量，并通過增強相關氧化劑的氧化能力和提高酶的活性參與了西柏三烯二醇的生物降解，促進了西柏三烯二醇向茄酮轉化的過程，進而提高初烤煙葉的茄酮含量，改善煙葉的抽吸品質。