豬肝酯酶農(nóng)藥敏感性及其與膽堿酯酶的對比研究

楊 莉，王羚佳，開 拓，黃玉坤，黃 瑛，楊 瀟，陳祥貴*

(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)省高校重點實驗室，四川 成都 610039；2.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 611731)

【研究意義】農(nóng)藥殘留是世界各國當(dāng)前面臨的食品安全問題之一[1]。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥使用量大面廣，監(jiān)管相對困難，農(nóng)藥殘留的快速檢測對于保障食品安全具有重要意義[2-4]。酶抑制法是目前國內(nèi)外農(nóng)藥殘留快速檢測中應(yīng)用最廣泛的方法[5]，該方法主要原理是：有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥可特異性地抑制膽堿酯酶的活性，因此在體外檢測中待測樣品對酶活性的抑制率與樣品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的含量呈正相關(guān)[6-8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自1962年Guilbault采用膽堿酯酶檢測農(nóng)藥以來[9]，國內(nèi)外大量的相關(guān)研究促進(jìn)了酶抑制法的發(fā)展與應(yīng)用，但存在酶源單一、靈敏度低等問題。各類商品化的檢測用酶源主要是來自家蠅、電鰻和電鰩的乙酰膽堿酯酶[10]，且大多數(shù)研究報道集中在各類傳感器的開發(fā)，而對新型酶源的研究較少[11-12]。羧酸酯酶是一類廣泛存在于各種生物的酶，來自生態(tài)毒理學(xué)研究提示羧酸酯酶對農(nóng)藥具有較好的敏感性，可作為酶抑制法的候選酶源[13]，但目前相關(guān)研究不多，其實踐應(yīng)用還鮮有報道。Gary等人研究揭示了不同酯酶對有機(jī)磷抑制劑具有不同的敏感性，豬肝酯酶對供試的幾種有機(jī)磷化合物具有較好的敏感性，但僅測試了2種常用有機(jī)磷農(nóng)藥，且未與目前快速檢測中常用的膽堿酯酶進(jìn)行敏感性對比[14]?！颈狙芯壳腥朦c】豬肝酯酶來源豐富、廉價，因此本文選用豬肝酯酶為酶源，以AChE-ee、BChE-hs為對照，同時測定并比較3種酶對農(nóng)藥的敏感性，【擬解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步研究豬肝酯酶作為酶抑制法的酶源提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

電鰻乙酰膽堿酯酶(AChE-ee，Acetyl cholinesterase of electric eel)、馬血清丁酰膽堿酯酶(BChE-hs， Butyryl cholinesterase of horse serum)、豬肝酯酶(PLE，Porcine liver esterase)，購自美國Sigma公司。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱、滅多威、克百威、丁硫克百威、殘殺威、涕滅威，購自國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心。

碘化硫代丁酰膽堿(BTChI; S-Butyrylthiocholine iodide)、乙酸-1-萘酯、固藍(lán)B鹽、毒扁豆堿(Eserine)、鹽酸多奈哌齊(Donepezil Hydrochloride)，購自美國Sigma公司；碘代硫代乙酰膽堿(ATChI; S-Acetylthiocholine iodide)、5,5'-二硫代-2,2'-二硝基苯甲酸(DTNB; 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，購自美國Fluka公司；雙(4-硝基苯基)磷酸酯(BNPP；Bis(4-nitrophenyl)phosphoric acid)，購自日本TCI公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3599酶標(biāo)板，corning公司；Infinite F200熒光化學(xué)發(fā)光分析儀，瑞士Tecan公司；Research?plue單道可調(diào)移液器，德國Eppendorf公司；高速冷凍離心機(jī)，centrifuge 5810R，德國Eppendorf公司；電子天平，TB-214，北京賽多利斯儀器有限公司；分光光度計，UV2600A，上海龍尼柯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PLE酶活的測定 PLE敏感性的測定方法參照鄧光輝等的Ellman法，并有一定的改進(jìn)[15-16]，作為底物的乙酸-1-萘酯被PLE分解為乙酸和甲萘酚，甲萘酚與固藍(lán)B鹽作用，生成紫紅色偶氮化合物，在590 nm處有吸收。

在96孔板中依次加入50 μl 0.02 mol/L(pH 6.5)的磷酸緩沖液、50 μl PLE和100 μl 1.0 mM乙酸-1-萘酯液，混勻后，在40 ℃下保溫反應(yīng)一定時間后，加入100 μl 0.25 % 固藍(lán)B鹽，在590 nm處測量其OD值，計算酶相對活力。

1.3.2 溫度對PLE酶活的影響 分別在25、30、35、40、45 ℃，pH 6.5條件下，測定酶活力，并以最適反應(yīng)溫度下的酶活力作為100 %計算。每處理重復(fù)3次。

1.3.3 pH對PLE酶活的影響 分別在pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 條件下，35 ℃恒溫反應(yīng)，測定酶活力，并以最適反應(yīng)pH下的酶活力作為100 %計算。每處理重復(fù)3次。

1.3.4 酶特異性抑制劑對PLE酶活的影響 在酶促反應(yīng)體系中，分別加入50 μl 2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6mol/L的BNPP、毒扁豆堿、鹽酸多奈哌齊溶液，測定酶活力，以不加抑制劑的酶活力作為100 %計算。每處理重復(fù)3次。

1.3.5 農(nóng)藥對PLE的最佳作用時間 取4種有機(jī)磷農(nóng)藥(敵敵畏、敵百蟲、久效磷、甲胺磷)以及2種氨基甲酸酯農(nóng)藥(克百威、滅多威)用丙酮溶解成濃度為2×10-1mol/L的母液，并用0.02 mol/L pH 7.0 磷酸緩沖液梯度稀釋至2×10-4mol/L，按照1.3.1 方法分別與PLE反應(yīng)，測定不同反應(yīng)時間下對PLE酶活的抑制率。

酶抑制率計算公式為：

其中：A0：無抑制時反應(yīng)體系的OD值；A1：有農(nóng)藥抑制時反應(yīng)體系的OD值。

1.3.6 AChE-ee敏感性的試驗方法 AChE-ee敏感性的測定參照何紹志的ELLman方法，并有一定的改進(jìn)[17]，作為底物的碘化硫代乙酰膽堿被AChE-ee分解為乙酸和硫代膽堿，硫代膽堿與DTNB作用，生成黃色的絡(luò)合物，在410 nm波長處測其光密度(OD)。

設(shè)置3組對照組，一組無底物ATChI和農(nóng)藥，一組無AChE-ee和農(nóng)藥，另一組無農(nóng)藥；另外設(shè)置6組實驗組，按照預(yù)先配制好的農(nóng)藥溶液，將有機(jī)磷農(nóng)藥：敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱和氨基甲酸酯類農(nóng)藥：滅多威、克百威、丁硫克百威、殘殺威、涕滅威依次加入反應(yīng)體系中。體系以PB為反應(yīng)底液，先加入50 μl AChE-ee和50 μl農(nóng)藥溶液，在37 ℃下保溫10 min；再加入100 μl ATChI和100 μl DTNB，在410 nm光源處測量其10 min內(nèi)的OD值。不足300 μl的體系用PB補(bǔ)足，每個處理重復(fù)3次。

1.3.7 BChE-hs敏感性的試驗方法 BChE-hs敏感性的測定方法參照V.Gorun改進(jìn)的Ellman法[18-20]，作為底物的碘化硫代丁酰膽堿被 BChE-hs 分解為丁酸和硫代膽堿，硫代膽堿與DTNB 作用，生成黃色的絡(luò)合物，在410 nm波長有吸收。

設(shè)置3組對照組，一組無底物BTChI和農(nóng)藥，一組無BChE-hs和農(nóng)藥，另一組無農(nóng)藥；另外設(shè)置6組實驗組，按照預(yù)先配制好的農(nóng)藥溶液，將1.3.6提到的農(nóng)藥依次加入反應(yīng)體系中。體系以PB為反應(yīng)底液，先加入50 μl BChE-hs和50 μl農(nóng)藥溶液，在37 ℃下保溫10 min；再加入100 μl BTChI和100 μl DTNB，在410 nm光源處測量其10 min內(nèi)的OD值。不足300 μl的體系用PB補(bǔ)足，每個處理重復(fù)3次。

1.3.8 PLE敏感性的試驗方法 PLE敏感性測定方法參照鄧光輝等Ellman法，并有一定的改進(jìn)[15]。設(shè)置3組對照組，一組無底物乙酸-1-萘酯和農(nóng)藥，一組無PLE和農(nóng)藥，另一組無農(nóng)藥；另外設(shè)置6組實驗組，按照預(yù)先配制好的農(nóng)藥溶液，將1.3.6提到的農(nóng)藥依次加入反應(yīng)體系中。體系以PB為反應(yīng)底液，先加入50 μl PLE和50 μl農(nóng)藥溶液，在37 ℃下保溫10 min；再加入100 μl 乙酸-1-萘酯在37 ℃下反應(yīng)10 min；最后加入100 μl 固藍(lán)B鹽，在590 nm光源處測量其10 min內(nèi)的OD值。不足300 μl的體系用PB補(bǔ)足，每個處理重復(fù)3次。

以-lgC為X坐標(biāo)，以抑制率H( %)為Y坐標(biāo)，繪制折線圖。

圖1 溫度對酶活性的影響Fig.1 Effect of temperature on PLE activity

1.3.9 農(nóng)藥半抑制濃度(IC50)的計算方法 根據(jù)不同濃度的農(nóng)藥(C，mol/L)對酶的抑制率(H， %)，參照馮艷萍等[21]的計算方法，以農(nóng)藥終濃度 -lg(C)為橫坐標(biāo)，lg [H/ (1-H)]為縱坐標(biāo)繪制曲線，當(dāng)所得曲線方程Y= 0時，即H=1-H，抑制率H=50 %，所求得的X對應(yīng)的濃度C值即為半抑制濃度IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對酶活性的影響

由圖1可知，PLE在溫度為35 ℃時酶活力最高，為其最佳反應(yīng)溫度；溫度過高或過低均導(dǎo)致酶活力的降低。

2.2 pH對酶活性的影響

pH是影響酶活的主要參數(shù)之一，由圖2可知，PLE最適反應(yīng)pH值為7.0。

2.3 反應(yīng)時間對PLE酶活的影響

實驗從5～25 min范圍內(nèi)，反應(yīng)時間對PLE酶活影響如圖3所示，最佳反應(yīng)時間是15 min。

2.4 抑制劑對PLE酶活性的影響

毒扁豆堿是膽堿酯酶抑制劑，鹽酸多奈哌齊是AChE-ee特異性抑制劑，雙(4-硝基苯基)磷酸酯是羧酸酯酶抑制劑，三者對PLE的抑制作用如圖4所示。

圖2 pH對PLE酶活測定的影響Fig.2 Effect of pH on PLE activity

圖3 反應(yīng)時間對PLE酶活測定的影響Fig.3 Effect of time on PLE activity

圖4 酶抑制劑對豬肝酯酶活力的影響Fig.4 Effect of inhibitors on PLE activity

由圖4所知，在實驗濃度范圍(10-6～10-3mol/L)，鹽酸多奈哌齊僅在10-3mol/L時對PLE有抑制效果，并且只有48.82 %；當(dāng)濃度為10-3mol/L時，毒扁豆堿與BNPP對PLE完全抑制；當(dāng)濃度為10-4mol/L時，BNPP對PLE能夠完全抑制，而毒扁豆堿抑制率為90.44 %；當(dāng)濃度為10-5與10-6mol/L時，BNPP對PLE的抑制率依然高于毒扁豆堿，并且高于70 %以上。由此可知，PLE對3種抑制劑敏感性的順序為：BNPP>毒扁豆堿>鹽酸多奈哌齊。

2.5 農(nóng)藥對PLE的最佳作用時間

由圖5可得，敵敵畏、敵百蟲、克百威對PLE的抑制效果顯著，在3～25 min實驗范圍內(nèi)，抑制率保持在90 %。而滅多威、甲胺磷、久效磷在的抑制率隨著抑制時間的延長而逐漸上升，當(dāng)在15 min之后，抑制率H( %)變化不顯著，趨近于穩(wěn)定。因此，農(nóng)藥對PLE的最佳作用時間為15 min。

圖5 作用時間對豬肝酯酶活力的影響Fig.5 Effect of reaction time on PLE activity

2.6 不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥對酶的抑制作用

圖6為5種常見有機(jī)磷農(nóng)藥(敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱)分別對PLE、AChE-ee以及BChE-hs的抑制率折線圖。從圖6可以看出，隨著農(nóng)藥濃度的降低，5種農(nóng)藥對3種酶的抑制率均呈下降趨勢。當(dāng)農(nóng)藥濃度為10-3mol/L時，除毒死蜱外，其余4種農(nóng)藥對3種酶的抑制均達(dá)到最大值。當(dāng)農(nóng)藥濃度在10-4～10-6mol/L時，抑制率隨農(nóng)藥濃度降低而迅速降低。當(dāng)農(nóng)藥濃度低至10-8mol/L時，5種農(nóng)藥對3種酶的抑制均低于20 %。同種農(nóng)藥在不同濃度下，酶源的敏感性不相同；當(dāng)農(nóng)藥濃度為10-4mol/L時，敵敵畏與敵百蟲對PLE與BChE-hs的抑制率均達(dá)到95 %以上，而對AChE-ee的抑制率卻只有87 %左右。當(dāng)農(nóng)藥濃度為10-8mol/L時，敵敵畏與敵百蟲對AChE-ee的抑制率依然有20 %以上，而對PLE與BChE-hs的抑制率均低于10 %。

表1 3種酯酶對5種有機(jī)磷農(nóng)藥敏感性對比

表2 3種酯酶對5種氨基甲酸酯農(nóng)藥敏感性對比

注：Y為lg[H(1-H)]，X為- lgC。

2.7 不同濃度的氨基甲酸酯類農(nóng)藥對酶的抑制作用

圖7為5種常見氨基甲酸酯類農(nóng)藥(滅多威、克百威、丁硫克百威、殘殺威、涕滅威)分別對PLE、AChE-ee以及BChE-hs的抑制率折線圖。當(dāng)農(nóng)藥濃度為10-3mol/L時，5種氨基甲酸酯農(nóng)藥對PLE的抑制率均達(dá)到90 %以上，隨著濃度降低，同等濃度下不同種農(nóng)藥對PLE的抑制率逐漸不同。此外，同種酶源對不同種農(nóng)藥的敏感性不同，當(dāng)農(nóng)藥濃度為10-6mol/L時，克百威與殘殺威對AChE-ee的抑制率可達(dá)到80 %，滅多威與丁硫克百威卻僅為70 %左右，涕滅威甚至只有40 %左右；丁硫克百威對BChE-hs抑制率可達(dá)到80 %以上，克百威僅50 %左右，滅多威、殘殺威、涕滅威卻不到20 %。由此可知，PLE對滅多威最敏感，其次是AChE-ee，BChE-hs最末。

2.8 PLE及AChE-ee、BChE-hs農(nóng)藥敏感性比較

根據(jù)生態(tài)毒理學(xué)中IC50值與酶對農(nóng)藥敏感性的關(guān)系，IC50值越小，表明酶對其越敏感。本文以line weaver-Burk法分析5種常見有機(jī)磷農(nóng)藥和5種常見氨基甲酸酯類農(nóng)藥在不同濃度下對3種酶源的抑制結(jié)果，由表1～2可知，農(nóng)藥濃度與抑制率的相關(guān)性均達(dá)到9.0以上，表明線形關(guān)系良好。PLE、AChE-ee及BChE-hs對不同有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性順序分別為：①敵敵畏：PLE>BChE-hs>AChE-ee；②敵百蟲：PLE>AChE-ee>BChE-hs；③甲胺磷：AChE-ee>PLE>BChE-hs；④辛硫磷：BChE-hs>AChE-ee>PLE；⑤毒死蜱：PLE>BChE-hs>AChE-ee。PLE、AChE-ee及BChE-hs對不同氨基甲酸酯類的敏感性順序分別為：①滅多威：AChE-ee>PLE>BChE-hs；②克百威：AChE-ee>PLE>BChE-hs；③丁硫克百威：PLE>AChE-ee>BChE-hs；④殘殺威：AChE-ee-ee>PLE>BChE-hs；⑤涕滅威：PLE>AChE-ee>BChE-hs。

5種有機(jī)磷農(nóng)藥中，PLE對敵敵畏、敵百蟲、毒死蜱的敏感性均高于AChE-ee與BChE-hs，其中敵百蟲與毒死蜱均比AChE-ee與BChE-hs提高1個數(shù)量級；而對甲胺磷與辛硫磷，PLE與AChE-ee均處于同1數(shù)量級。因此，PLE對有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性跟AChE-ee或BChE-hs有著顯著的差異，并且在針對某一特定農(nóng)藥時，以IC50值為對照，其敏感性可比AChE-ee與BChE-hs高1～2個數(shù)量級，比如毒死蜱。

5種氨基甲酸酯農(nóng)藥中，PLE對涕滅威與丁硫克百威的敏感性均高于AChE-ee與BChE-hs，其中對丁硫克百威的敏感性比AChE-ee高1個數(shù)量級，比BChE-hs高2個數(shù)量級。PLE對滅多威、克百威、殘殺威的敏感性雖然不如AChE-ee，甚至對滅多威與克百威的敏感性比AChE-ee還低1個數(shù)量級，但與BChE-hs處于同一量級。因此，PLE對氨基甲酸酯農(nóng)藥的敏感性跟BChE-hs有著顯著差異，甚至針對某一特定農(nóng)藥，如丁硫克百威，其敏感性可比AChE-ee或BChE-hs高1～2個數(shù)量級。

A. PLE對有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制率； B. AChE-ee對有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制率；C. BChE-hs對有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制率圖6 酶對有機(jī)磷農(nóng)藥抑制率的影響Fig.6 Inhibiting effect of enzymes activity on organophoshorus pesticides

A. PLE對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的抑制率；B. AChE-ee對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的抑制率；C. BChE-hs對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的抑制率圖7 酶對氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制率的影響Fig.7 Inhibiting effect of enzymes activity on carbamate pesticides

3 討 論

豬肝酯酶是從豬肝中提取的一種羧酸酯水解酶，它是使用最廣泛合成光學(xué)活性醇的酯酶，在水解羧酸酯酶時具有高度立體選擇性[22]，且其價格低廉，來源廣泛，對大多數(shù)農(nóng)藥有良好的敏感性，實用價值高，可作為尋找新敏感酶源的實驗材料。本研究系統(tǒng)試驗了PLE酶學(xué)性質(zhì)、與AChE-ee和BChE-hs進(jìn)行農(nóng)藥敏感性對比研究，為PLE用于農(nóng)藥殘留快速檢測提供了依據(jù)。

農(nóng)藥能夠抑制生物體內(nèi)膽堿酯酶的活性，引起神經(jīng)系統(tǒng)中毒。不同來源的膽堿酯酶在結(jié)構(gòu)上差異明顯，表現(xiàn)出對農(nóng)藥不同的敏感性。AChE-ee對氨基甲酸酯類農(nóng)藥甲萘威、速滅威的IC50值分別為1.002、7.568 μmol/L[17]；BChE-hs對和氨基甲酸酯類農(nóng)藥滅多威、速滅威的IC50值分別為22.58、24.18 μmol/L[23]；本實驗AChE-ee對有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱的IC50值分別為5.812、2.405、10.870、6.570、>1000 μmol/L，對氨基甲酸酯類農(nóng)藥滅多威、克百威、丁硫克百威、殘殺威、涕滅威的IC50值分別為0.340、0.045、0.046、0.069、0.871 μmol/L；BChE-hs對有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱的IC50值分別為5.110、3.440、57.370、0.359、278 μmol/L，對氨基甲酸酯類農(nóng)藥滅多威、克百威、丁硫克百威、殘殺威、涕滅威的IC50值分別為34.140、0.930、0.236、12.6、5.55 μmol/L。本研究與已有研究數(shù)據(jù)趨勢一致。Gary等人研究表明，豬肝酯酶對毒死蜱的IC50為0.01～0.1 μmol/L，對敵敵畏的IC50為1～10 μmol/L；本文PLE對有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱的IC50值分別為1.133、0.542、18.08、11.90、18.06 μmol/L，對氨基甲酸酯類農(nóng)藥滅多威、克百威、丁硫克百威、殘殺威、涕滅威的IC50值分別為5.527、0.259<0.01、0.098、0.791 μmol/L。PLE對農(nóng)藥敵敵畏敏感性與Gary等人研究結(jié)論基本一致；PLE在敵敵畏、敵百蟲、毒死蜱的敏感性上明顯優(yōu)于AChE-ee，并且5種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性全部優(yōu)于BChE-hs；PLE在丁硫克百威、殘殺威、涕滅威的敏感性上與AChE-ee基本一致，本研究的5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥與BChE-hs相比，敏感性明顯更強(qiáng)。

基于實驗環(huán)境、實驗操作等因素影響，相同酶源在不同測定條件下，得出結(jié)果可能不同[24]。李德玲等研究了PLE對毒死蜱的敏感性[25]，表明豬肝酯酶能較好地用于毒死蜱檢測。目前對豬肝酯酶農(nóng)藥敏感性研究數(shù)據(jù)還不完善，本實驗數(shù)據(jù)表明，PLE對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性可以達(dá)到μmol水平，與前人研究一致；對毒死蜱的敏感性也在μmol水平。PLE可作為快速檢測農(nóng)藥殘留的酶源。

4 結(jié) 論

豬肝酯酶活性測定方法的最佳溫度、時間、pH分別為35 ℃、15 min、7.0；農(nóng)藥對豬肝酯酶的最適抑制時間為15 min；本實驗結(jié)果表明，豬肝酯酶對BNPP敏感性最高，毒扁豆堿次之，最低為鹽酸多奈哌齊，此結(jié)果進(jìn)一步證明了豬肝酯酶對水解羧酸類化合物有特異性。

通過對5種有機(jī)磷農(nóng)藥和5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對PLE、AChE-ee、BChE-hs的酶活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PLE無論對有機(jī)磷農(nóng)藥還是氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性都要優(yōu)于BChE-hs；與AChE-ee相比，除了有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷、辛硫磷，氨基甲酸酯類農(nóng)藥滅多威、克百威外，PLE的敏感性更好。

PLE具有來源廣泛，易于提取，價廉等優(yōu)點。豬肝中PLE含量豐富，對氨基甲酸酯類的農(nóng)藥敏感性高，與常用的膽堿酯酶相比，對多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性較好，可作為酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留用酶的候選酶源。