外源蛋白酶對肉雞飼糧體外降解效率的影響

王 雄 唐小懿 陳鳳鳴,2 陳清華*

(1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128；2.湖南領道農業(yè)環(huán)?？萍加邢薰?，長沙 410128)

外源蛋白酶具有改善畜禽生長性能、提高飼糧蛋白質消化利用率等功能[1]，但其功能的發(fā)揮不僅取決于自身的酶學特性，還與目標動物及基礎飼糧組成緊密相關。用動物試驗法評定外源蛋白酶有效性復雜、耗時，因此，尋求一種簡單、快速的體外法用來評定外源蛋白酶的有效性已成為飼料生產和養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求。體外法分為外源酶法、內源酶法和仿生消化酶法3種[2]。外源酶法的代表是Boisen等[3]建立的胃蛋白酶-胰液素法，前人研究表明外源酶法能快速評定外源酶有效性，可作為動物試驗的預試驗，但也存在精確性較差、結果不穩(wěn)定等缺點[4-6]。內源酶法所用消化酶穩(wěn)定性差，試驗結果可比性差，基本退出體外評定體系[2]。而仿生消化酶法對畜禽消化生理的模擬程度更高，對畜禽飼糧具有很好的生物學效價，可利用仿生法篩選畜禽飼糧的最佳酶譜及酶添加量[7-8]。但利用仿生法評定外源蛋白酶有效性的研究較少。因此，本試驗通過單胃動物仿生消化系統(tǒng)建立肉雞體外模擬消化模型，研究外源蛋白酶對肉雞飼糧體外降解效率的影響，確定蛋白酶最適添加量，為快速評價蛋白酶的有效性提供方法參考，并為其在肉雞中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

外源蛋白酶：由山東隆科特酶制劑有限公司提供，實測含11 464 U/g酸性蛋白酶、25 635 U/g中性蛋白酶和21 655 U/g堿性蛋白酶。酶活定義：在特定pH(酸性蛋白酶pH=3.0、中性蛋白酶pH=7.5和堿性蛋白酶pH=10.5)，40 ℃條件下，每分鐘水解酪素產生1 μg酪氨酸所需酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2 試驗飼糧及試驗設計

試驗飼糧參照NY/T 33—2004《黃羽肉雞飼養(yǎng)標準》[9]和NRC(1994)肉雞營養(yǎng)需要[10]標準配制。基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗采用單因素完全隨機設計，對照組為肉雞基礎飼糧[分前期(1～21日齡)和后期(22～42日齡)]，試驗組分別在肉雞前期和后期基礎飼糧中添加100、200、400和800 mg/kg的外源蛋白酶，試驗共10種飼糧樣品，每種飼糧樣品設5個重復，每個重復1根仿生消化管。飼糧采用四分法取樣后，用小型飼料粉碎機粉碎過60目篩，充分混合均勻后-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗方法

本試驗使用單胃動物仿生消化系統(tǒng)(SDS-Ⅲ)模擬飼糧在雞的胃腸道的消化過程。仿生消化操作過程中透析袋的型號和前處理、胃緩沖液和小腸緩沖液的配制和儀器運行參數(shù)等參照文獻[11]。

操作步驟：稱取(2±0.000 2) g飼糧樣品置于裝有透析袋的仿生消化管中，并加入20 mL已配好的胃液。將仿生消化管固定在已預熱的單胃動物仿生消化系統(tǒng)上，連通事先配制的胃、小腸段緩沖液。胃階段模擬消化過程(41 ℃條件下消化4 h)結束后時，準確地將2 mL小腸液移入單胃動物仿生消化系統(tǒng)的小腸消化液儲備室中，繼續(xù)進行7.5 h的小腸前段消化和7.5 h的小腸后段消化。消化過程結束后，將消化殘渣無損轉移到已絕干恒重的培養(yǎng)皿中，放在65 ℃烘箱中烘干至無水痕后，105 ℃烘干至恒重。將培養(yǎng)皿中的消化殘渣全部刮下，轉移到已絕干恒重的玻璃砂芯坩堝中，無水乙醇脫脂(用無水乙醇沖洗殘渣3次)后105 ℃烘干至恒重。根據(jù)以下公式計算樣品脫脂后干物質消化率、總能消化率和酶水解物能值[12]：

DMD(%)=(M1-M2)/M1×100；GED(%)=(GE1-GE2)/GE1×100；EHGE=(GE1-GE2)/(M1×1 000)。

式中：DMD為飼糧體外干物質消化率(%)；GED為飼糧體外總能消化率(%)；EHGE為飼糧體外酶水解物能值(MJ/kg)；M1為上樣飼糧干物質重量(g)；M2為未消化殘渣干物質重量(g)；GE1為上樣飼糧總能(MJ)；GE2為未消化殘渣總能(MJ)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1)預混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kilogram of diets：TiO25 000 mg，VA 12 000 IU，VD32 500 IU，VE 20 IU，VK33.2 mg，VB13.0 mg，VB210.0 mg，VB66.0 mg，生物素 biotin 0.1 mg，泛酸 pantothenic acid 20.0 mg，葉酸 folic acid 1.25 mg，F(xiàn)e 90 mg，Zn 80 mg，Mn 1 000 mg，Cu 10 mg，I 0.5 mg，Se 0.15 mg。
2)營養(yǎng)水平均為計算值。Nutrient levels were all calculated values.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，用Duncan氏法進行多重比較，并對不同蛋白酶添加量的效應進行線性和二次回歸分析，結果用平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 外源蛋白酶對肉雞前期飼糧體外干物質消化率、總能消化率和酶水解物能值的影響

由表2可知，與對照組相比，200 mg/kg蛋白酶組干物質消化率顯著提高(P<0.05)，其他加酶組干物質消化率有提高趨勢(P>0.05)，且干物質消化率與蛋白酶的添加量呈二次線性關系(P<0.05)。100、200和400 mg/kg蛋白酶組總能消化率和酶水解物能值均顯著高于對照組(P<0.05)，總能消化率、酶水解物能值與蛋白酶的添加量呈二次線性關系(P<0.05)。

表2 外源蛋白酶對肉雞前期飼糧體外干物質消化率、總能消化率和酶水解物能值的影響Table 2 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE in vitro of broiler starter diet

同行數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
Values in the same row with different letter superscripts differ significantly (P<0.05). The same as below.

2.2 外源蛋白酶對肉雞后期飼糧體外干物質消化率、總能消化率和酶水解物能值的影響

由表3可知，與對照組相比，試驗組干物質消化率和總能消化率顯著提高(P<0.05)，且干物質消化率和總能消化率與蛋白酶的添加量呈二次線性關系(P<0.05)；肉雞后期基礎飼糧添加100、200和400 mg/kg蛋白酶后，胃腸道酶水解物能值顯著提高(P<0.05)，且酶水解物能值與蛋白酶的添加量呈二次線性關系(P<0.05)。

表3 外源蛋白酶對肉雞后期飼糧體外干物質消化率、總能消化率和酶水解物能值的影響Table 3 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE in vitro of broiler finisher diet

3 討 論

與其他體外法相比，基于單胃動物仿生消化系統(tǒng)的仿生法具有“標準化、儀器化、自動化”等優(yōu)勢，能確保試驗結果的準確性和精確性[13-15]。張立蘭等[12]研究表明，通過單胃動物仿生消化系統(tǒng)可預判外源蛋白酶的有效性，且飼糧全消化道干物質消化率及酶水解物能值和外源蛋白酶添加量具有較好的線性回歸關系。本試驗結果表明，外源蛋白酶可提高肉雞玉米-豆粕型全期基礎飼糧體外干物質消化率、總能消化率和酶水解物能值，且三者與蛋白酶添加量呈二次線性關系。Fru-Nji等[16]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞玉米-豆粕型基礎飼糧中添加蛋白酶可顯著提高能量利用率；Stefanello等[17]分別在肉雞豆粕型和玉米-豆粕型半純合飼糧中添加蛋白酶，干物質和能量的回腸末端和全消化道消化率顯著提高；Angel等[18]研究表明，在7～22日齡肉雞飼糧中添加蛋白酶可提高飼糧養(yǎng)分的表觀消化率，這都與本試驗結果相符。外源蛋白酶可降低飼糧中抗營養(yǎng)因子，提高飼糧水解效率，從而增加其可消化性。如黃明媛[19]發(fā)現(xiàn)蛋白酶能快速降解豆粕中抗營養(yǎng)因子，有效提高豆粕消化率；Lahaye等[20]報道蛋白酶能夠消除大豆中的胰蛋白酶抑制因子；Yu等[21]采用胃蛋白酶-胰液素體外法研究表明蛋白酶可促進大豆蛋白的降解。外源蛋白酶除了降解飼糧中蛋白質和抗營養(yǎng)因子外，可能也影響著模擬腸消化中內源酶的活性。李慧[22]發(fā)現(xiàn)在肉雞飼糧中添加327 mg/kg蛋白酶，有提高內源酶分泌的趨勢，添加2 619 mg/kg蛋白酶使1～21日齡和22～42日齡肉雞小腸食糜淀粉酶活性分別降低了8.75%和28.14%；周梁[23]發(fā)現(xiàn)添加200 mg/kg的蛋白酶使肉仔雞空腸食糜的胰蛋白酶活性、糜蛋白酶活性均有顯著提高；800 mg/kg的蛋白酶添加量能顯著降低胰腺的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。本試驗中，飼糧體外干物質消化率、總能消化率和酶水解物能值隨著蛋白酶添加量的增加呈先升高后降低的變化，有可能是適宜外源蛋白酶添加量能提高內源酶活性，外源蛋白酶添加量過高則抑制了內源酶活性。本試驗結果表明，肉雞前期和后期基礎飼糧中添加200 mg/kg外源蛋白酶，飼糧降解效果最好；通過單胃動物仿生消化系統(tǒng)可快速評定蛋白酶有效性，也為蛋白酶在肉雞飼糧中的應用提供科學依據(jù)。

4 結 論

適量外源蛋白酶可顯著提高肉雞基礎飼糧體外降解效率；本試驗中，200 mg/kg蛋白酶組體外降解效率最高。