肉雞雞胚十二指腸上皮細胞的體外分離、鑒定及其原代培養(yǎng)吸收模型的構(gòu)建與評估

張樹敏 廖秀冬 呂 林 張麗陽 羅緒剛

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，礦物元素營養(yǎng)研究室，北京 100193)

小腸是動物重要的消化器官，是營養(yǎng)物質(zhì)主要的消化與吸收的場所。而小腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IEC)作為體內(nèi)更新最快的一類細胞，是腸道內(nèi)外環(huán)境的媒介，又是機體免疫屏障的重要組成部分，具有消化、吸收、分泌、免疫等重要的生理功能[1]。小腸上皮細胞在一定條件下可進行體外分離和培養(yǎng)。體外分離培養(yǎng)小腸上皮細胞對于研究腸道生物學功能、營養(yǎng)物質(zhì)吸收機制及其調(diào)控以及小腸上皮細胞增殖和分化提供了簡單、快速的手段，并為研究營養(yǎng)素及其他外界因素對腸上皮的作用提供了理想的體外模型[2]。一般而言，體外培養(yǎng)胚胎組織比成體組織更易生存和生長，因而其細胞分離后容易培養(yǎng)成功。而成體組織中大部分是非繁殖的分化細胞，當細胞分化時生長受到嚴重抑制或完全停止，并且成體組織的年齡越大，體外培養(yǎng)的成功率越低，這可能與胚胎干細胞的分化水平有關(guān)，故成體來源組織培養(yǎng)細胞增殖極為困難，且培養(yǎng)周期縮短[3]。李艷等[4]選取9胚齡雞胚，Guo等[5]選取17胚齡雞胚，馬玉龍等[6]和古少鵬等[7]選取18胚齡雞胚，Derache等[8]選用大于18胚齡的將出殼雞胚，賈國東等[9]選取20胚齡雞胚進行小腸上皮細胞原代培養(yǎng)，均已成功構(gòu)建小腸上皮細胞體外原代培養(yǎng)模型。以上文獻中選取的雞胚多集中在18胚齡左右，故本試驗選用18胚齡雞胚十二指腸上皮細胞進行原代培養(yǎng)。但是關(guān)于原代培養(yǎng)腸上皮細胞用于物質(zhì)吸收試驗未見報道，有諸多研究用Caco-2細胞進行培養(yǎng)作為物質(zhì)吸收模型[10-13]，并進行其單層模型細胞緊密連接性的評估[14-15]。本實驗室前期Liu等[16]用半體內(nèi)半體外的原位結(jié)扎灌注腸段法研究發(fā)現(xiàn)，磷在肉雞原位結(jié)扎灌注腸段中的主要吸收腸段是十二指腸，胡義信[17]用自然飼喂法進一步深入研究證實磷在肉雞自然飼喂過程中的主要吸收腸段是十二指腸，與Liu等[16]研究結(jié)果一致。在以上2個試驗的基礎(chǔ)上，用體外原代培養(yǎng)十二指腸上皮細胞的方法，可進一步證實磷在肉雞雞胚原代培養(yǎng)十二指腸上皮細胞中的轉(zhuǎn)運吸收規(guī)律及其分子機制。因此，本研究采用Caco-2細胞評估其單層模型細胞連接緊密性的方法，來評估十二指腸上皮細胞不同接種密度在不同培養(yǎng)時間下對細胞連接緊密性及細胞活力的影響，為建立肉雞雞胚體外原代培養(yǎng)十二指腸上皮細胞吸收模型選擇最佳的細胞接種密度，并最終構(gòu)建十二指腸上皮細胞原代培養(yǎng)的物質(zhì)吸收模型。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，共設(shè)3個組，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組十二指腸上皮細胞接種密度分別為2.90×106、6.25×106、8.75×106個/mL，每個組6個重復，每個重復包含2個培養(yǎng)孔。

1.2 試驗動物

18胚齡的愛拔益加(AA)肉雞雞胚，由河北灤平華都肉雞公司提供。

1.3 主要試劑和儀器

主要試劑：杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、臺盼藍、膠原酶Ⅰ，購于Gibco公司；青-鏈霉素、肝素鈉，購于Sigma公司；表皮細胞生長因子、噻唑藍(MTT)試劑盒，購于上海凡歌生物化工公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/四唑硝基藍(BCIP/NBT)堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)研究所；鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、4%多聚甲醛，購于武漢博士德生物工程有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；細胞角蛋白18抗體，購于博奧森公司；胰島素，購于邁晨科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：150、500目細胞過濾篩(北京索萊寶科技有限公司)，超純水凈化裝置(Milli-Q，美國Biocell公司)，自動滅菌鍋(TOMY SS-325)，臺式離心機(Eppendorf)，0.22 μm濾器(美國Millipore公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，相差倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，超凈工作臺(YJ-1450型醫(yī)用凈化工作臺，蘇州長橋凈化設(shè)備廠)，Millicell-ERS電阻儀(美國Millipore公司)，50 mL離心管、60 mm細胞培養(yǎng)皿、6孔細胞培養(yǎng)板、96孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)，全波長酶標儀(美國Biotek公司)。

1.4 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細胞的消化、分離

參考Guo等[5]和Qin等[18]的消化分離細胞的方法，取18胚齡AA肉雞雞胚，用75%酒精擦其外殼，晾干后在無菌條件下取出十二指腸，用解剖器械取出腸組織，置于盛有預冷的含2%青-鏈霉素的D-PBS中，用鑷子剔除十二指腸中夾帶的胰臟及其筋膜，用含2%青-鏈霉素的D-PBS反復清洗2～3次。用剪刀將十二指腸組織剪成0.5 cm長的小段，轉(zhuǎn)移至盛有30 mL DMEM/F12培養(yǎng)基的50 mL離心管中，劇烈振蕩數(shù)次，將清洗液吸出，重復2～3次。然后將腸段剪成小于1 mm3的組織塊碎片，靜置數(shù)分鐘自行沉淀，用DMEM/F12腸段清洗液沖洗3～4次至上清液澄清，吸棄洗液。

向沉淀中加入10倍體積的1 mg/mL膠原酶Ⅰ消化液消化，在37 ℃水浴箱中慢速(80循環(huán)/min)振蕩消化50 min，消化完畢后，于1 000×g離心8 min，棄上清去除酶消化液。繼續(xù)向沉淀中加入10 mL DMEM/F12腸段清洗液懸浮沉淀，輕輕吹打混勻，于1 000×g離心8 min，棄上清，重復該洗滌操作1～2次。加入10 mL DMEM/F12貼壁培養(yǎng)液懸浮沉淀，反復輕柔吹打5～10次，用150和500目的細胞篩連續(xù)過濾懸液以去除組織塊和成纖維細胞，留在500目篩上的細胞團用DMEM/F12貼壁培養(yǎng)液沖洗下來，制成細胞懸液，用臺盼藍染色法進行十二指腸上皮細胞活細胞率的檢測。

1.5 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細胞活細胞率的檢測

用彭彬等[19]使用的臺盼藍染色法進行十二指腸上皮細胞活細胞率檢測。主要步驟為：取200 μL細胞懸液，加入等量0.4%的臺盼藍溶液，混勻后取1滴于細胞計數(shù)板上，輕輕蓋上蓋玻片，于相差倒置顯微鏡下觀察。分別計數(shù)未染色的細胞數(shù)(活細胞)和染色的細胞數(shù)(死細胞)?；罴毎视嬎悖?/p>

活細胞率(%)=100×活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))。

當活細胞率達到95%以上時，可用于以下的十二指腸上皮細胞培養(yǎng)。

1.6 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細胞的培養(yǎng)

采用DMEM/F12培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另外添加胎牛血清濃度為3%，用制成的DMEM/F12貼壁培養(yǎng)液將獲得的十二指腸上皮細胞團進行懸浮，制成細胞懸液，當活細胞率達到95%以上且按照以上試驗設(shè)計調(diào)整細胞密度，隨即取1.5 mL細胞懸液接種于Transwell 6孔細胞培養(yǎng)板的上槽中，另取沒有細胞的DMEM/F12培養(yǎng)基2.6 mL于Transwell 6孔細胞培養(yǎng)板的下槽中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，共培養(yǎng)4 d。

1.7 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細胞堿性磷酸酶染色鑒定

采用洪智敏等[2]的方法進行雞胚十二指腸上皮細胞堿性磷酸酶染色鑒定。原代培養(yǎng)的十二指腸上皮細胞貼壁生長48 h后，選取已接種培養(yǎng)細胞的1塊6孔細胞培養(yǎng)板，吸出6個培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液并以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，洗去未貼壁細胞及碎片雜質(zhì)，并加入4%多聚甲醛固定液固定30 min。隨后以PBS洗滌2次去除固定液，即可用于鑒定。其中3個培養(yǎng)孔作為陽性試驗組，3個培養(yǎng)孔作為陰性對照組。具體操作步驟按照BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒說明進行。

1.8 樣品采集與制備

在細胞培養(yǎng)的第24、48、72、96 h，立即收集培養(yǎng)孔上槽中細胞培養(yǎng)液0.5 mL于滅菌的1.5 mL離心管中，將2個培養(yǎng)孔的細胞培養(yǎng)液收集合為1個重復，共收集6個重復，于3 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清置于-20 ℃冰箱中保存，以備測定細胞培養(yǎng)液中LDH活力；隨即棄去Transwell 6孔細胞培養(yǎng)板上、下槽中剩余細胞培養(yǎng)液，用含酚紅培養(yǎng)基和無酚紅培養(yǎng)基測定細胞酚紅透過率，細胞樣品收集于滅菌的1.5 mL離心管中，置于-20 ℃冰箱中保存以備測定其酚紅透過率；用Millcell-ERS電阻儀測量每個培養(yǎng)孔的跨膜電阻(transepithelial electrical resistance,TEER)值。連續(xù)測定收集4 d。

1.9 樣品分析

分別于細胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后，取上、下槽培養(yǎng)液0.5 mL于具塞試管中，分別加入1 mol/L NaOH溶液5 mL顯色，搖勻后以1 mol/L NaOH溶液為空白，在560 nm下測定吸光度(OD)。按以下公式計算細胞酚紅透過率：

酚紅透過率(%)=100×OD下層/(OD上層+OD下層)。

細胞生長孔TEER值計算：

TEER值(Ω·cm2)=(細胞生長孔值-空白孔值)×微孔面積。

式中：微孔面積為Transwell 6孔細胞培養(yǎng)板插入槽的面積，為4.67 cm2。

將每天收集的6個重復的細胞培養(yǎng)液解凍，參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進行LDH活力測定。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SAS 9.0[20]軟件中一般線性模型(general linear model,GLM)程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進行單因素方差分析，以每個重復分析樣本作為1個試驗單元。方差分析差異顯著者，以最小顯著差數(shù)法(least significant difference,LSD)比較平均值間的差異顯著性。以P<0.05作為數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗標準。

2 結(jié) 果

2.1 體外原代培養(yǎng)AA肉雞雞胚十二指腸上皮細胞分離觀察結(jié)果

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，可獲得大量的十二指腸上皮細胞團和極少量的單個腸上皮細胞，剛分離的十二指腸上皮細胞團呈球形，且細胞團的大小均一，懸浮于培養(yǎng)液中(圖1-A)。Ⅰ組細胞團之間空隙較大，Ⅱ組細胞團之間仍有較多空隙，Ⅲ組細胞團之間的空隙明顯變小，經(jīng)臺盼藍染色鑒定，3個組細胞活率均在95%以上，以上結(jié)果表明，此次分離獲得的十二指腸上皮細胞適用于原代細胞培養(yǎng)模型的構(gòu)建。

2.2 體外原代培養(yǎng)AA肉雞雞胚十二指腸上皮細胞形態(tài)學觀察結(jié)果

在倒置生物顯微鏡下每隔24 h觀察各處理細胞生長狀態(tài)、形態(tài)特征。在細胞培養(yǎng)的24 h，十二指腸上皮細胞團沉于培養(yǎng)板底部，已經(jīng)開始貼壁，貼壁的細胞團開始向外伸展，逐漸鋪成片；Ⅰ組的細胞團貼壁伸展較好，貼壁后的細胞表面較為平整；Ⅱ組仍可見部分未完全伸展開的細胞團；Ⅲ組可見大量未伸展開的細胞團(圖1-B)。在細胞培養(yǎng)的48 h，Ⅰ組和Ⅱ組的已貼壁細胞之間界限清晰，排列緊密，細胞呈單層分布，多呈卵石狀、橢圓狀，排列緊密，細胞呈“鋪路石樣”生長；Ⅲ組細胞間界限模糊，有較多未貼壁的死亡細胞團依附在上面(圖1-C)。在細胞培養(yǎng)的72 h，Ⅰ組和Ⅱ組的細胞界限依然較為清晰，排列緊密，細胞呈單層分布，依然可見“鋪路石樣”生長的細胞；Ⅲ組細胞模糊不清，細胞脫落明顯(圖1-D)。在細胞培養(yǎng)的96 h，3個組的細胞都開始有部分脫落，細胞形狀開始變得模糊不清，此時細胞基本上不再增殖；Ⅰ組和Ⅱ組已貼壁的十二指腸上皮細胞之間界限變得模糊不清，開始有部分脫落；Ⅲ組細胞脫落后留下許多空泡，細胞脫落明顯(圖1-E)。以上結(jié)果表明，Ⅰ組和Ⅱ組細胞在培養(yǎng)的48和72 h，細胞之間界限清晰、生長狀態(tài)良好、貼壁均勻，具備了做試驗處理的條件。

圖1 原代培養(yǎng)不同時間肉雞雞胚十二指腸上皮細胞形態(tài)變化Fig.1 Morphological change of primary cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos under different cultivated time

2.3 AA肉雞雞胚十二指腸上皮細胞堿性磷酸酶染色鑒定結(jié)果

在原代培養(yǎng)的十二指腸上皮細胞貼壁生長48 h后，以Ⅰ組的細胞為例，采用洪智敏等[2]的方法進行十二指腸上皮細胞堿性磷酸酶染色鑒定，結(jié)果見圖2。陽性試驗組的十二指腸上皮細胞胞漿被染成了藍黑色(染色率在95%以上)，成纖維細胞或血細胞等雜細胞不著色，另外，陰性對照組的十二指腸上皮細胞未被染色。以上結(jié)果表明，本試驗所獲得的細胞是分化完全、功能健全的十二指腸上皮細胞。

圖2 原代培養(yǎng)48 h肉雞雞胚十二指腸上皮細胞堿性磷酸酶染色情況Fig.2 Alkaline phosphatase staining of primary cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos after 48 h cultivations

2.4 十二指腸上皮細胞TEER值測定結(jié)果

在細胞培養(yǎng)的24、48、72、96 h，對已貼壁的十二指腸上皮細胞測定其TEER值，見圖3。從相同細胞密度不同培養(yǎng)時間角度看，3個組細胞的TEER值均隨著細胞培養(yǎng)時間的變化有顯著差異(P<0.05)，Ⅰ組和Ⅱ組細胞的TEER值的變化趨勢相似，Ⅰ組細胞的TEER值在細胞培養(yǎng)的48和72 h均顯著高于24和96 h(P<0.05)，并且在48和72 h，細胞的TEER值維持恒定不變(P>0.05)；Ⅱ組細胞的TEER值在細胞培養(yǎng)的48 h顯著高于24和96 h(P<0.05)；Ⅲ組細胞的TEER值在細胞培養(yǎng)的24 h時最高，在48、72和96 h均顯著降低(P<0.05)。

從相同培養(yǎng)時間不同細胞密度角度看，在細胞培養(yǎng)的24 h，Ⅰ組細胞的TEER值顯著低于Ⅱ組和Ⅲ組(P<0.05)；在細胞培養(yǎng)的48、72和96 h，Ⅰ組細胞的TEER值顯著高于Ⅱ組(P<0.05)，Ⅱ組細胞的TEER值顯著高于Ⅲ組(P<0.005)。從數(shù)值上看，Ⅰ組和Ⅱ組細胞的TEER值在48 h均達到最高狀態(tài)并持續(xù)到72 h，且Ⅰ組細胞的TEER值均大于Ⅱ組。

2.5 十二指腸上皮細胞酚紅透過率測定結(jié)果

在細胞培養(yǎng)的24、48、72、96 h，對已貼壁的十二指腸上皮細胞測定其酚紅透過率，見圖4。從相同細胞密度不同培養(yǎng)時間角度看，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組細胞的酚紅透過率均隨著細胞培養(yǎng)時間的變化有顯著差異(P<0.05)，Ⅰ組和Ⅱ組細胞的酚紅透過率的變化趨勢相似，在細胞培養(yǎng)的24、48和72 h，細胞的酚紅透過率隨細胞培養(yǎng)時間的推移而顯著降低(P<0.05)，在細胞培養(yǎng)的96 h，細胞的酚紅透過率顯著增加(P<0.05)；Ⅲ組細胞的酚紅透過率在細胞培養(yǎng)的24和48 h時均較低，在細胞培養(yǎng)的72和96 h均顯著增高(P<0.05)。

數(shù)據(jù)點不同小寫字母表示相同細胞密度不同培養(yǎng)時間之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示相同培養(yǎng)時間不同細胞密度之間差異顯著(P<0.05)。下圖同。
Value datapoints with different small letters mean significant difference in the same cell density at different culture time (P<0.05), and with different capital letters mean significant difference at the same culture time in different cell density (P<0.05). The same as below.
圖3原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞的TEER值
Fig.3 TEER values of primary cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos (n=6)

從相同培養(yǎng)時間不同細胞密度角度看，在細胞培養(yǎng)的48、72和96 h，Ⅰ組和Ⅱ組的細胞酚紅透過率均顯著低于Ⅲ組(P<0.05)。

圖4 原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞的酚紅透過率Fig.4 Phenol red transmittance rate of primary cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos (n=6)

2.6 十二指腸上皮細胞培養(yǎng)液中LDH活力測定結(jié)果

在細胞培養(yǎng)的24、48、72、96 h，測定細胞培養(yǎng)液中的LDH活力，見圖5。從相同細胞密度不同培養(yǎng)時間角度看，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力均隨著細胞培養(yǎng)時間的變化有顯著差異(P<0.05)，Ⅰ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細胞培養(yǎng)的24、48和72 h沒有顯著變化(P>0.05)，在細胞培養(yǎng)的96 h顯著增加(P<0.05)；Ⅱ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細胞培養(yǎng)的24、48 h均在較低水平，在細胞培養(yǎng)的72、96 h顯著增高(P<0.05)；Ⅲ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細胞培養(yǎng)的24、48和72 h隨細胞培養(yǎng)時間的推移而顯著增高(P<0.05)，在細胞培養(yǎng)的96 h顯著降低(P<0.05)。

從相同培養(yǎng)時間不同細胞密度角度看，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力在24、48、72 h均有顯著差異(P<0.05)，在細胞培養(yǎng)的24和48 h，Ⅰ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力顯著低于Ⅱ組(P<0.05)，Ⅱ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力顯著低于Ⅲ組(P<0.05)；在細胞培養(yǎng)的72 h，Ⅰ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力顯著低于Ⅲ組(P<0.05)，Ⅲ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力顯著低于Ⅱ組(P<0.05)；在細胞培養(yǎng)的96 h，Ⅰ組和Ⅱ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力均顯著高于Ⅲ組(P<0.05)。從數(shù)值上看，Ⅰ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細胞培養(yǎng)的24、48、72 h均維持在較低的水平，在細胞培養(yǎng)的96 h開始明顯升高。

圖5 原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞培養(yǎng)液中的LDH活力Fig.5 LDH activity of primary cultured duodenal epithelial cells medium of broiler embryos (n=6)

3 討 論

常用的細胞純化的方法主要有差速貼壁法、機械刮除法和用細胞篩篩選等方法。差速貼壁法主要利用成纖維細胞比腸道上皮細胞貼壁速度快的特點，大部分成纖維細胞能在短時間內(nèi)(1～2 h)完成附著過程，而大部分腸上皮細胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，此時收集未貼壁的含大量腸上皮細胞團的細胞懸液，重新接種于新的培養(yǎng)板中，利用此差別可以純化細胞，從而獲得較多的腸上皮細胞團。許多研究利用差速貼壁法去除成纖維細胞等雜細胞，從而獲得腸上皮細胞團[4-5,9]。但用這種方法進行操作，會損失掉一部分已貼壁的腸上皮細胞團，使細胞懸液中腸上皮細胞團的密度降低，且成纖維細胞無法去除干凈。在原代培養(yǎng)時，上皮細胞和成纖維細胞往往會分區(qū)成片混雜生長，每種細胞都以小片或成區(qū)域的分布方式生長在瓶壁上，采用機械刮除的方法去除不需要的成纖維細胞區(qū)域而保留需要的上皮細胞區(qū)域，用這種方法往往容易造成污染、細胞在培養(yǎng)孔孔底分布不均勻等情況。用150～500目的細胞篩連續(xù)過濾細胞懸液，先用150目細胞篩來篩除未被消化的較大組織塊，然后用500目篩篩除直徑較小的血細胞、成纖維細胞和單個腸上皮細胞，而直徑相對較大的腸上皮細胞團無法經(jīng)過500目篩，留在500目篩上的細胞團用細胞培養(yǎng)液沖洗下來，制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)板中就可進行細胞培養(yǎng)[21-22]。用這種方法可以很有效地去除大量成纖維細胞和難以貼壁增殖的單個腸上皮細胞，最終留在細胞懸液中大部分為腸上皮細胞團。本研究采用了150～500目細胞篩連續(xù)過濾的方法進行去除成纖維細胞，獲得大量十二指腸上皮細胞團，并經(jīng)形態(tài)學觀察及堿性磷酸酶染色鑒定，很少有成纖維細胞、血細胞等雜細胞污染，細胞純化較為徹底。

目前，鑒定小腸上皮細胞的常用方法有形態(tài)學鑒定、堿性磷酸酶染色法、免疫細胞化學法等[23-25]。本試驗的十二指腸上皮細胞增殖迅速，在培養(yǎng)的2～3 d數(shù)量顯著增多，形成集落，呈單層“鋪路石樣”生長，邊界清晰，互不重疊，多呈扁平多角狀、卵石狀、橢圓狀，符合原代培養(yǎng)腸上皮細胞的形態(tài)特征。然而，僅憑在顯微鏡下觀察具有腸上皮細胞特征的細胞不能確定為小腸上皮細胞，只能確定為類腸上皮細胞，還需要進一步鑒定。堿性磷酸酶是小腸上皮細胞微絨毛上的標志性酶[2,24]，該酶凝集于腸細胞表面，參與細胞內(nèi)消化及上皮細胞脫落到腸腔內(nèi)的細胞外消化過程，能被成功染色的細胞即為十二指腸上皮細胞。洪智敏等[2]、楊文平等[26]和賈國東等[9]均采用堿性磷酸酶染色鑒定法成功鑒定十二指腸上皮細胞。

Caco-2細胞單層的緊密連接性一般用細胞TEER值和標志物的表觀通透系數(shù)來評價。其中TEER值測定是目前公認的一種簡單而權(quán)威性的評價方法，細胞層的緊密連接與TEER值具有密切相關(guān)，當TEER值增長到一定水平(通常為大于300 Ω·cm2)后即表明細胞單層的緊密連接性好[27]。TEER值越大，說明細胞緊密連接越強[28-31]。酚紅為水溶性小分子物質(zhì)，不易被腸黏膜代謝且不會通過細胞膜轉(zhuǎn)運，可以間接反映單層細胞之間連接處的通透量，作為細胞單層連接緊密性的標示物。因此，本試驗采用酚紅作為探針評價在Transwell 6孔細胞培養(yǎng)板的插槽內(nèi)培養(yǎng)的十二指腸上皮細胞間連接的緊密性，酚紅透過率小于5%作為細胞單層形成的標志[30]。在本試驗中細胞培養(yǎng)的24、48和72 h，Ⅰ組和Ⅱ組細胞的TEER值均滿足大于300 Ω·cm2的試驗要求，酚紅透過率均滿足小于5%的試驗要求，并且2組細胞的TEER值在48 h均達到最高狀態(tài)并持續(xù)到72 h，另外，Ⅰ組細胞的TEER值均大于Ⅱ組，細胞酚紅透過率均小于Ⅱ組，說明Ⅰ組已貼壁的十二指腸上皮細胞間緊密連接性更強。由此可見，細胞TEER值、酚紅透過率也可以作為評估原代培養(yǎng)十二指腸上皮細胞緊密連接性的指標。

LDH是機體細胞內(nèi)一種穩(wěn)定存在的酶，當細胞膜受到損害時，它就會通過細胞膜從細胞內(nèi)漏出到細胞外，因此，細胞培養(yǎng)液中LDH活力的高低在一定程度上反映了細胞的損傷程度[32-34]。Qin等[18]通過測定原代培養(yǎng)心肌細胞培養(yǎng)液中的LDH活力，來作為判斷熱應(yīng)激心肌細胞損傷的標志。所以，本試驗通過測定十二指腸上皮細胞培養(yǎng)液中LDH活力來間接反映十二指腸上皮細胞膜的完整性及細胞活力。本試驗中Ⅰ組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力在細胞培養(yǎng)的24、48、72 h均維持在較低的水平，在細胞培養(yǎng)的96 h開始顯著升高，而其他2組細胞培養(yǎng)液中的LDH活力在72 h就已經(jīng)明顯升高，表明Ⅰ組已貼壁的十二指腸上皮細胞在細胞培養(yǎng)的24、48和72 h生長狀態(tài)最好、活力最佳。

4 結(jié) 論

綜合以上細胞形態(tài)學、TEER值、酚紅透過率、細胞培養(yǎng)液中的LDH活力4項指標得出，在細胞培養(yǎng)的48 h，2.90×106個/mL細胞密度組細胞生長狀態(tài)良好，細胞之間界限清晰、緊密連接性強，細胞活力最佳，因此，原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞的物質(zhì)吸收模型構(gòu)建成功，并且該組細胞所用的接種密度(2.90×106個/mL)可以作為后續(xù)十二指腸上皮細胞的吸收規(guī)律及其分子機制的研究試驗中所用的細胞接種密度。