L-茶氨酸對過氧化氫誘導山羊瘤胃上皮細胞凋亡的保護作用

孔志偉 揭紅東 陳 亮 任 傲 周傳社 譚支良

(1.中國科學院大學，北京 100049；2.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術中心，農業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學觀測實驗站，長沙 410125；3.湖南農業(yè)大學動物科技學院，長沙 410128；4.湖南畜禽安全生產協同創(chuàng)新中心，長沙 410128)

畜禽在氧化應激的狀態(tài)下，細胞內會產生大量的氧自由基(OFR)，OFR破壞生物膜，影響細胞正常功能，導致細胞膜磷脂過氧化，蛋白質(受體和酶)過氧化以及DNA的氧化損傷。脂質、蛋白質和DNA的氧化會對生物體造成不同程度的危害，從而影響機體的生長、發(fā)育、衰老等過程。急性和慢性的應激都能通過產生自由基誘導胃腸道的氧化應激[1]。長期應激會導致動物體內自由基進一步增加，造成具有抗氧化能力的維生素和微量元素等的消耗，免疫受限，畜禽抵抗疾病能力下降，從而誘發(fā)一系列疾病，甚至死亡[2-3]。試驗證實，許多類型的胃腸潰瘍與活性氧有關[4-5]。并且過氧化氫(H2O2)是胃黏膜細胞氧化損傷的主要活性氧[6]。

目前許多文獻表明，重金屬(砷、鉛、汞等)、真菌毒素、殺蟲劑、過高的能量和蛋白質[7-9]、過高的鐵和銅[10-11]等催化劑、飼喂氧化的脂肪[12-13]、外傷、缺乏抗氧化物質(硒，維生素A、維生素E、維生素C、玉米黃素等)[14-16]等因素都可能導致氧化應激的發(fā)生，并可誘發(fā)消化道損傷[17]，從而影響機體對營養(yǎng)物質的消化吸收[18]。幼齡動物的食物結構和環(huán)境發(fā)生變化，也會導致氧化應激的發(fā)生。特別是當動物遭受外傷等應激后，引起腸缺血，產生大量超氧自由基，伴隨著黏膜中黃嘌呤及其底物次黃嘌呤聚集，再次被轉換成其他毒性更強的羥自由基。張燕輝等[19]證實缺血再灌注影響腸道通透性、電解質分泌、黏液釋放，通常導致腸炎的發(fā)生。

L-茶氨酸是綠茶中的呈味物質，是一種天然的氨基酸，在食品行業(yè)已被廣泛應用。L-茶氨酸作為茶科植物中的主要活性成分，在細胞和組織內主要通過氨基酸轉載系統進行轉運，對腦組織[20-21]和肝組織損傷[22-23]具有積極的保護作用；同時，在免疫細胞、神經細胞和癌細胞中具有特有的作用機制和作用靶點[24-25]。

H2O2是一種重要的活性氧成分，過量的H2O2因氧化應激損傷可以導致許多類型的細胞發(fā)生凋亡[26-27]。有研究表明，L-茶氨酸具有抗氧化活性，它能保護神經細胞免受各種刺激引起的凋亡[28-29]。L-茶氨酸能否抑制瘤胃上皮細胞的凋亡，從而拮抗氧化應激對瘤胃上皮細胞的損傷，對于反芻家畜胃腸道發(fā)育具有十分重要的意義。且L-茶氨酸的保護機制與其抗氧化活性和抑制凋亡等相關。試驗表明，Bcl-2家族在哺乳動物的細胞調亡中發(fā)揮了重要的作用，主要定位在不可逆細胞損傷的上游，在線粒體水平上起作用[30]。Bcl家族可以分為2類：一類是抗調亡蛋白，如Bcl-2；另一類是促調亡蛋白如Bax。Bax可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產生阻抑作用，它們通過激活下游一系列基因發(fā)揮調節(jié)調亡的作用[31]。本研究以H2O2刺激的瘤胃上皮細胞氧化應激模型來研究L-茶氨酸對H2O2誘導的瘤胃上皮細胞損傷的保護作用，為闡明L-茶氨酸的瘤胃上皮保護作用機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、青-鏈霉素均購自美國Gibco公司；兩性霉素B、慶大霉素購自美國Thermo Fisher Scientific(R-015-10)；L-茶氨酸(CAS：3081-61-6，純度≥99%)、噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；Bax、β-肌動蛋白(β-actin)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；Bcl-2一抗購自美國Signaling Antibody Biotechnology公司；二抗均購自美國Calbiochem公司；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；瓊脂糖購自上海麥克林生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；DEPC、EB試劑購自北京賽百盛基因技術有限公司；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；Taq酶、DNA分子質量標準(DL2000 DNA Marker)、dNTP購自美國MBI Fermntas公司；引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司；SYBGreen PCR Mix購自日本TaKaRa公司；常規(guī)化學試劑購自北京化學試劑公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 山羊瘤胃上皮細胞的分組

選擇4只42日齡、體重為(6.4±0.8) kg、健康的湘東黑山羊為試驗動物。頸靜脈放血致死，取出瘤胃組織，去掉內容物后用生理鹽水反復沖洗干凈，待用于樣品采集[32]。鈍性剝離瘤胃上皮，浸泡于4 ℃含1 000 U/mL青-鏈霉素、125 μg/mL慶大霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基中，轉移至細胞培養(yǎng)室；組織用含500 U/mL青-鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)液清洗3～5次；將組織盡量剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化液；37 ℃空氣浴振蕩消化，收集酶解液，加入適量完全培養(yǎng)基(含100 U/mL青-鏈霉素、25 μg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B、0.25 U/mL胰島素、10 ng/mL表皮生長因子)重懸細胞，經100 μm孔徑篩網過濾，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，去上清，將細胞重懸于DMEM/F12培養(yǎng)基中，并調整細胞濃度為1×107個/mL，置于CO2培養(yǎng)箱，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)。

當山羊瘤胃上皮原代細胞長滿培養(yǎng)皿的80%～90%時，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞1～2次后，加入1 mL的含0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA的消化液，放入含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中消化2～3 min。放在倒置顯微鏡下觀察細胞開始變亮、變圓時，迅速用完全培養(yǎng)基終止消化。將貼壁的細胞吹打為懸液，轉移到15 mL離心管中，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 mL的完全培養(yǎng)基重懸細胞，以1∶2的比例進行傳代。在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，轉移含細胞的培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，重復1次，進一步純化[33]。純化后的山羊瘤胃上皮細胞繼續(xù)培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，待細胞密度達到60%～70%時，分為5組，對照組采用完全培養(yǎng)基，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別在完全培養(yǎng)基中添加800 μmol/L H2O2、4 mmol/LL-茶氨酸+800 μmol/L H2O2、8 mmol/LL-茶氨酸+800 μmol/L H2O2和16 mmol/LL-茶氨酸+800 μmol/L H2O2，每組3個重復。

1.2.2 MTT法檢測瘤胃上皮細胞存活率

將純化后的山羊瘤胃上皮細胞按1×106個/mL的密度接種于96孔板中，待細胞密度達到60%～70%時，分為6組，對照組采用完全培養(yǎng)基，陽性對照組在完全培養(yǎng)基中添加8 mmol/LL-茶氨酸，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別在完全培養(yǎng)基中添加800 μmol/L H2O2、4 mmol/LL-茶氨酸+800 μmol/L H2O2、8 mmol/LL-茶氨酸+800 μmol/L H2O2和16 mmol/LL-茶氨酸+800 μmol/L H2O2，每組12個重復。按照設計劑量先加入L-茶氨酸預孵育1 h，再加入H2O2。培養(yǎng)12 h后，將96孔板中的培養(yǎng)基吸棄，用無菌PBS洗滌3次后，每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，放置37 ℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液。每孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，酶標儀上在570 nm波長處測定各孔的吸光度(OD)值，以對照組為參比計算細胞存活率(%)，公式如下：

細胞存活率(%)=100×陽性對照組或試驗組OD570 nm/對照組OD570 nm。

1.2.3 流式細胞儀檢測山羊瘤胃上皮細胞周期和凋亡

將純化后的山羊瘤胃上皮細胞按1×106個/mL的密度接種于6孔板中，待細胞密度達到60%～70%時，分為5組，對照組采用完全培養(yǎng)基，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別在完全培養(yǎng)基中添加800 μmol/L H2O2、4 mmol/LL-茶氨酸+800 μmol/L H2O2、8 mmol/LL-茶氨酸+800 μmol/L H2O2和16 mmol/LL-茶氨酸+800 μmol/L H2O2，每組6個重復。按照設計劑量先加入L-茶氨酸預孵育1 h,再加入H2O2。培養(yǎng)12 h后，應用流式細胞術(flow cytometry，FCM)中碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法檢測細胞周期[34]。

1.2.4 瘤胃上皮細胞凋亡基因的表達

分組及操作與1.2.3相同。培養(yǎng)12 h后，采用TRIZOL一步法抽提各組樣品中總RNA，整個過程戴口罩和一次性手套[32]；總RNA樣品的DNase Ⅰ處理參考文獻[35-36]進行，逆轉錄參考文獻[37-38]及試劑盒說明書進行。

1.2.5 引物設計與合成

根據新基因的測序結果，利用分子生物學軟件Primer premier 5、Primer 3.0、Oligo 6.71設計引物，并用Blast工具進行引物特異性分析。運用實時定量PCR檢測其組織特異性，所用引物如表1所示，引物由上海生工基因技術有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.6 蛋白質印跡(Western blot)試驗

分組及操作與1.2.3相同，各組樣品總蛋白質的提取和Western blot試驗操作流程參照文獻[39-40]。

1.3 數據統計與分析

采用SAS 9.2 GLM模型對細胞周期數據進行統計[41]，應用contrast語句分別進行組間的顯著性比較。通過運用LSMEANS方法來計算平均值。運用正交多項式對比來檢查P值的相關效應(線性或者二次)。在正交多項式分析之前，使用SAS 9.2的IML程序來校正系數[42]。P<0.05定義為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 L-茶氨酸對H2O2損傷的瘤胃上皮細胞存活率的影響

由表2可知,與對照組相比，Ⅰ組瘤胃上皮細胞存活率顯著降低(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組分別為(65.28±9.10)%和(77.17±7.39)%，顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。結果提示，H2O2能顯著降低瘤胃上皮細胞存活率，當L-茶氨酸在8 mmol/L以上時可以拮抗H2O2的作用。

2.2 L-茶氨酸對H2O2誘導瘤胃上皮細胞細胞周期的影響

由圖1和表3可知，與對照組相比，Ⅰ組G0/G1期細胞比例顯著增加(P<0.05)，S期細胞比例顯著減少(P<0.05)，同時G2期細胞比例顯著增加(P<0.05)，說明H2O2可將細胞周期阻滯在G0/G1期。與Ⅰ相比，Ⅱ組S期細胞比例差異不顯著(P>0.05)，而G2期細胞比例顯著增加(P<0.05)，由此說明400 mmol/LL-茶氨酸+H2O2可將細胞阻滯在G2期。而與Ⅰ相比，Ⅲ和Ⅳ組G0/G1期細胞比例顯著降低(P<0.05)，S期細胞比例顯著增加(P<0.05)，說明高于800 mmol/LL-茶氨酸+H2O2可將細胞周期阻滯在S期。由此說明，在H2O2誘導的氧化應激情況下，L-茶氨酸可以對瘤胃上皮細胞形成S期阻滯，又能形成G2期阻滯，最終緩解細胞凋亡。

表2 L-茶氨酸對H2O2損傷的瘤胃上皮細胞存活率的影響Table 2 Effects of L-theanine on SR of rumen epithelial cells injured by H2O2 %

同行數據肩標相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
Values in the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.3 L-茶氨酸對H2O2誘導瘤胃上皮細胞凋亡基因表達量的影響

由表4可知，與對照組比較，試驗組Bax、Bcl-2基因表達量分別升高和降低，Ⅰ、Ⅱ組變化顯著(P<0.05)。與Ⅰ組比較，對照組及Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組Bax基因表達量均顯著降低(P<0.05);對照組及Ⅳ組Bcl-2基因表達量均顯著增加(P<0.05)。與對照組比較，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組Bcl-2/Bax均顯著降低(P<0.05)。

2.4 L-茶氨酸對H2O2誘導山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡蛋白表達量的影響

由圖2和表5可知，與對照組相比，Ⅰ組Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達量提高(P<0.05)，Bcl-2/Bax顯著降低(P<0.05)，說明H2O2刺激后能引起瘤胃上皮細胞中Bcl-2蛋白表達量下調和Bax蛋白表達量上調，使得Bcl-2/Bax降低。與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組Bcl-2蛋白表達量顯著提高(P<0.05)，Bax蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組Bcl-2/Bax顯著提高(P<0.05)。結果提示，L-茶氨酸能緩解由H2O2引起的Bcl-2和Bax蛋白表達量的變化。

3 討 論

3.1 L-茶氨酸對H2O2誘導山羊瘤胃上皮細胞凋亡比率的影響

高濃度氧直接損傷瘤胃上皮細胞，促使細胞凋亡或使胃部疾病惡化。大量OFR是引起細胞損傷的重要原因之一，缺血再灌注、藥物代謝、金屬中毒等會誘導細胞產生大量OFR[43]，而H2O2作為OFR的主要成分，得到廣泛的研究[44-46]。H2O2可導致細胞損傷的機制包括:損傷線粒體和耗竭ATP，氧化細胞內蛋白質和細胞脂質及引起DNA損傷，引起細胞凋亡等[47]。

A、B、C、D、E分別為對照組及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組。
A, B, C, D and E represented control group and groups Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ, respectively.
圖1L-茶氨酸對H2O2誘導瘤胃上皮細胞周期的影響
Fig.1 Effects ofL-theanine on cell cycle of rumen epithelial cells induced by H2O2

表3 L-茶氨酸對H2O2誘導瘤胃上皮細胞不同細胞周期細胞比例的影響Table 3 Effects of L-theanine on proportions of cells at different cell cycles of rumen epithelial cells injured by H2O2 %

表4 L-茶氨酸對H2O2誘導山羊瘤胃上皮細胞凋亡基因表達量的影響Table 4 Effect of L-theanine on expression levels of apoptosis genes of ruminal epithelial cells injured by H2O2

圖2 L-茶氨酸對H2O2誘導山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡蛋白表達量的影響Fig.2 Effects of L-theanine on expression levels of apoptosis proteins of ruminal epithelial cells injured by H2O2

減少H2O2誘導細胞凋亡比率，對減輕過氧化應激對機體損傷的影響，改善機體功能與狀態(tài)具有非常重要的意義。本試驗結果表明，添加L-茶氨酸可緩解H2O2引起的山羊瘤胃上皮細胞氧化應激損傷。其機制可能是由于L-茶氨酸是谷氨酰胺的衍生物，在細胞內可代謝為谷氨酸，參與到谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成過程。此外，L-茶氨酸可以通過維持細胞內抗氧化酶的活性，一方面減少GSH的損耗，另一方面增加GSH的生成，達到穩(wěn)定細胞內GSH含量的效果，維持了細胞內的氧化還原平衡狀態(tài)，從而保護機體避免氧化應激反應的損傷[48]。

表5 L-茶氨酸對H2O2誘導山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡蛋白表達量的影響Table 5 Effects of L-theanine on expression levels of apoptosis proteins of ruminal epithelial cells injured by H2O2

3.2 L-茶氨酸對H2O2誘導山羊瘤胃上皮細胞凋亡基因和蛋白表達量的影響

在線粒體凋亡調控體系中，Bcl-2家族中抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL)或促凋亡蛋白(Bax、Bad和Bid)主要參與調節(jié)細胞凋亡。Bcl-2蛋白是線粒體膜上的一種凋亡調控蛋白，可以與線粒體膜上的電壓依賴性陽離子通道結合來調節(jié)促凋亡因子細胞色素c的釋放，也可以和Bax蛋白結合，阻斷其插入到線粒體膜上來維持線粒體的膜電位，而Bax是一種促凋亡蛋白，有研究發(fā)現，Bcl-2/Bax決定了線粒體通透性轉換孔(MPTP)的開放程度，形成調控細胞凋亡的樞紐，因此認為調控細胞死亡的“可變電阻器(rheostat)”是Bcl-2/Bax[49]。在內外因素刺激下，Bcl-2和Bax 2種調控因子的平衡決定細胞了生命，而Bcl-2/Bax是決定細胞凋亡發(fā)生及凋亡程度的重要因素[50]。因此，Bcl-2/Bax反映了細胞損傷的程度。研究發(fā)現，H2O2能誘導Bax蛋白表達量的增加，引起B(yǎng)cl-2蛋白表達量的降低，最終使Bcl-2/Bax降低，L-茶氨酸能緩解H2O2刺激后瘤胃上皮細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達量的變化，使Bcl-2/Bax升高，說明L-茶氨酸對抗H2O2誘導的瘤胃上皮細胞凋亡是通過抑制Bcl-2/Bax的升高來實現的。

4 結 論

①L-茶氨酸能通過抑制細胞凋亡來有效地保護由H2O2導致的瘤胃上皮細胞損傷，促進Bcl-2蛋白表達和抑制Bax蛋白表達，抑制Bax/Bcl-2的升高是L-茶氨酸發(fā)揮抗凋亡作用的重要途徑之一。

② 體外條件下，培養(yǎng)液中添加的L-茶氨酸濃度高于8 mm/L時能有效發(fā)揮抗凋亡作用。