王 根 趙 芳 高 超 趙國棟 李曉斌 馬 晨 楊開倫
(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點實驗室,烏魯木齊 830052)
哺乳動物體內(nèi)褪黑素(melatonin,ML)是主要由松果體和腸黏膜合成和分泌的一種吲哚類激素,廣泛分布在很多器官、組織和細胞中[1-2]。研究顯示,ML可促進綿羊卵母細胞成熟[3]、維持精子功能[4]、促進胚胎發(fā)育[5]和提高機體的抗氧化能力[6],因此適當提高綿羊體內(nèi)ML含量可能對其生殖和抗氧化性能具有重要的意義。色氨酸(tryptophan,Trp)作為動物體內(nèi)一種重要的功能性氨基酸同時也是ML合成的前體物質(zhì),在體內(nèi)經(jīng)羥化、脫羧、乙酰化和甲基化形成ML。Huenther等[7]證實在鼠和雞飼糧中添加或腹腔注射150~300 mg/(kg BW·d) Trp后1 h血漿ML含量顯著增加,且存在劑量效應(yīng);由于反芻動物瘤胃內(nèi)棲居大量的微生物,Trp易被降解為吲哚、吲哚乙酸、糞臭素等物質(zhì),故直接飼喂反芻動物不能達到理想目的,而瘤胃保護性色氨酸(rumen protected tryptophan,RPTrp)可以有效降低其在瘤胃中的降解。研究表明,遼寧絨山羊添喂6 g/(只·d) RPTrp(Trp含量為33%),第30、60、90天血漿Trp含量顯著提高[8]。本課題組在前期奶牛試驗中也發(fā)現(xiàn),添喂RPTrp可提高血漿Trp含量及夜間血漿ML含量[9]。早期研究表明,腹腔注射500 mg/(kg BW·d) Trp,綿羊血漿ML含量并未增加[10]。為進一步證實能否通過提高綿羊腸道Trp吸收量來調(diào)節(jié)機體ML含量,本試驗選擇綿羊為試驗動物模型,通過在飼糧中添加一定量的Trp、RPTrp,測定綿羊血漿中Trp及5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)、ML等主要代謝物含量的變化,為通過飼糧中添加Trp或RPTrp來調(diào)節(jié)綿羊機體內(nèi)ML的含量提供科學(xué)依據(jù)。
本試驗于2017年6月至2017年7月在新疆惠康畜牧生物科技有限公司羊場進行,自然光照條件。采樣當天日出時間為06:37、日落時間為21:54,晝長15.27 h。
選擇年齡(3.0±0.5)歲、平均體重(53.49±2.41) kg、健康的薩??司d羊15只。
試驗羊只單欄位飼養(yǎng),每天每只羊的Trp、RPTrp、精料和玉米青貯平均分成2份,分別于08:00、20:00飼喂。為保證補喂的Trp或RPTrp采食完全,將Trp或RPTrp與50 g精料混勻后飼喂,待綿羊采食完畢后再投喂剩余精料、玉米青貯,自由采食混合干草,自由飲水。根據(jù)試驗羊場的飼養(yǎng)管理規(guī)定,定期打掃圈舍。綿羊干物質(zhì)采食量見表2。
血漿用于測定總色氨酸(total tryptophan,T-Trp)、Kyn、白蛋白(albumin,ALB)、游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)、5-HT、ML含量;上午飼喂后0 h時采集的血漿測定總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量;超濾管制備的血漿用于測定游離色氨酸(free tryptophan,F-Trp)含量。
利用高效液相色譜法測定血漿T-Trp、Kyn含量[12],血漿F-Trp含量測定參考謝占武等[13]的比色法進行。血漿ALB、FFA含量,上午飼喂后0 h時血漿T-AOC,GSH-Px、SOD活性,MDA含量送至南京建成生物工程研究所采用比色法檢測。血漿5-HT、ML含量由北京華英生物技術(shù)研究所采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定。
表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %
1)每千克精料含有 One kg of concentrate contained the following:玉米 corn 0.44 kg,燕麥 oat 0.16 kg,大麥 barley 0.15 kg,豆粕 soybean meal 0.20 kg,CaHPO40.03 kg,NaCl 0.01 kg,預(yù)混料 premix 0.01 kg。預(yù)混料為每千克精料提供 The premix provided the following per kg of the concentrate: VA 480 IU,VB1816 mg, VB2333 mg,VB649 mg,VD 70 U,VE 21 333 IU,泛酸 pantothenic acid20 mg,煙酰胺 nicotinamide 485 mg,Cu (as copper sulfate) 11 mg,F(xiàn)e (as ferrous sulfate)35 mg,Mn (as manganese sulfate) 33 mg,Zn (as zinc sulfate)31 mg,I (as potassium iodide) 2 mg,Se (as sodium selenite) 6 mg,Co (as cobalt chloride) 1 mg。
2)色氨酸含量為計算值,其他營養(yǎng)水平為實測值。Trp was a calculated value, while the other nutrient levels were measured values.
表2 綿羊干物質(zhì)采食量Table 2 Dry matter intake of sheep g/d
用Excel 2010進行試驗數(shù)據(jù)整理,SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,并用Duncan氏法進行多重比較,試驗結(jié)果均以平均值±標準差(mean±SD)表示,以P<0.05和P<0.01分別為差異顯著和極顯著的標準。
由表3可知,上午飼喂后,對照組綿羊血漿T-Trp含量在0~6 h呈現(xiàn)出下降后又上升的變化趨勢,6~10 h變化幅度較小,維持在30.61~32.95 μmol/L的范圍內(nèi);試驗Ⅰ組在0~2 h快速升高,2 h時極顯著高于對照組(P<0.01),2~4 h快速降低,4~10 h變化趨勢與對照組相似,2組間差異不顯著(P>0.05);試驗Ⅱ組血漿T-Trp含量與對照組相比均有所提高,變化趨勢相似,且在6 h時顯著高于對照組(P<0.05)。下午飼喂后,對照組和試驗組血漿T-Trp含量變化趨勢與上午飼喂后相似??傮w而言,與對照組相比,補喂Trp可短時迅速提高綿羊血漿T-Trp含量,而補喂RPTrp可持續(xù)小幅度提高血漿T-Trp含量。
表3 補喂Trp、RPTrp對綿羊血漿T-Trp含量的影響Table 3 Effects of Trp and RPTrp supplementations on plasma T-Trp content of sheep (n=5) μmol/L
同行數(shù)據(jù)肩標相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。
In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant different (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant different (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.
由表4可知,上午飼喂后,對照組血漿F-Trp含量在0~8 h變化較小,維持在7.39~7.98 μmol/L,8~10 h至下午飼喂后0 h從7.56 μmol/L持續(xù)升高至9.26 μmol/L;試驗Ⅰ組血漿F-Trp含量在上午飼喂后2 h時極顯著高于對照組和試驗Ⅱ組(P<0.01),對照組和試驗Ⅱ組間差異不顯著(P>0.05);試驗Ⅱ組在上午飼喂后2~6 h持續(xù)緩慢升高,在上午飼喂后6 h顯著高于對照組和試驗Ⅰ組(P<0.05),對照組和試驗Ⅰ組間差異不顯著(P>0.05)。下午飼喂后,試驗組與上午飼喂后變化趨勢基本一致;對照組血漿F-Trp含量在下午0~10 h呈先下降后升高的趨勢,在下午飼喂后4 h顯著低于試驗組(P<0.05),試驗組間差異不顯著(P>0.05)。
表4 補喂Trp、RPTrp對綿羊血漿F-Trp含量的影響Table 4 Effects of Trp and RPTrp supplementations on plasma F-Trp content of sheep (n=5) μmol/L
續(xù)表4采樣時間Sampling time時鐘點Clock time對照組Control group試驗Ⅰ組Trial group Ⅰ試驗Ⅱ組Trial group Ⅱ上午飼喂后10 h 10 h after feeding in the morning18:008.93±1.828.67±0.848.61±0.73下午飼喂后0 h 0 h after feeding in the afternoon19:309.26±1.929.00±1.629.80±2.21下午飼喂后2 h 2 h after feeding in the afternoon22:007.60±0.70Bb12.25±1.31Aa8.50±0.73Bb下午飼喂后4 h 4 h after feeding in the afternoon00:006.78±0.48b8.80±1.10a9.46±1.80a下午飼喂后6 h 6 h after feeding in the afternoon02:007.21±1.378.19±1.058.87±0.99下午飼喂后8 h 8 h after feeding in the afternoon04:007.61±1.547.62±1.019.39±0.93下午飼喂后10 h 10 h after feeding in the afternoon06:007.99±1.388.40±1.349.11±1.22
由表5可知,上午飼喂后,對照組綿羊血漿ALB含量呈先升高后降低的變化趨勢,試驗組與對照組變化趨勢相似,但血漿ALB含量峰值出現(xiàn)延遲,試驗Ⅰ、Ⅱ組分別出現(xiàn)在上午飼喂后4和6 h;上午飼喂后各組間差異均不顯著(P>0.05)。下午飼喂后,對照組和試驗組綿羊血漿ALB含量變化趨勢基本一致,均出現(xiàn)2個峰值,分別在下午飼喂后4和10 h,各組間差異也不顯著(P>0.05)。
4.支持開發(fā)核心技術(shù),保障網(wǎng)絡(luò)安全。習(xí)近平總書記指出: “網(wǎng)絡(luò)安全的本質(zhì)在對抗,對抗的本質(zhì)在攻防兩端能力較量。”地方政府要統(tǒng)籌推動網(wǎng)絡(luò)核心技術(shù)創(chuàng)新,支持本地企業(yè)、高校、科研機構(gòu)等突破核心技術(shù),加強對工業(yè)互聯(lián)網(wǎng)、人工智能、大數(shù)據(jù)等新技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域安全技術(shù)研究,構(gòu)建多領(lǐng)域、多層次的網(wǎng)絡(luò)核心技術(shù)體系。要積極培育壯大網(wǎng)絡(luò)安全產(chǎn)品服務(wù)市場,引導(dǎo)通信、能源、金融、交通等重要行業(yè)、重要領(lǐng)域加大關(guān)鍵信息基礎(chǔ)設(shè)施網(wǎng)絡(luò)安全投入,并不斷優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)業(yè)生態(tài),營造有利于網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展的地方環(huán)境,努力將核心技術(shù)牢牢掌握在自己手里,加快推進國產(chǎn)自主可控替代,構(gòu)建安全可控的信息技術(shù)體系。
表5 補喂Trp、RPTrp對綿羊血漿ALB含量的影響Table 5 Effects of Trp and RPTrp supplementations on plasma ALB content of sheep (n=5) g/L
由表6可知,上午飼喂后,各組綿羊血漿FFA含量呈先降低后升高的變化趨勢;試驗組在4 h至下午飼喂后0 h均低于對照組,但差異不顯著(P>0.05)。下午飼喂后,各組血漿FFA含量變化趨勢與上午飼喂后相似,但試驗組在下午飼喂后0~2 h降低較快,下午飼喂后2 h時極顯著低于對照組(P<0.01);其余時間點,各組間差異均不顯著(P>0.05)。
由表7可知,上午飼喂后,對照組和試驗Ⅱ組綿羊血漿Kyn含量變化幅度均較小,分別維持在3.19~3.79 μmol/L和3.56~4.35 μmol/L,各時間點試驗Ⅱ組均高于對照組,但差異不顯著(P>0.05);試驗Ⅰ組血漿Kyn含量在0~2 h快速升高,2 h時顯著高于對照組和試驗Ⅱ組(P<0.05)。下午飼喂后,對照組和試驗Ⅱ組綿羊血漿Kyn含量在2~8 h持續(xù)小幅升高,2組間差異不顯著(P>0.05);試驗Ⅰ組的變化趨勢與上午飼喂后相似,在2 h時顯著高于對照組和試驗Ⅱ組(P<0.05)。
表6 補喂Trp、RPTrp對綿羊血漿FFA含量的影響Table 6 Effects of Trp and RPTrp supplementations on plasma FFA content of sheep (n=5) g/L
表7 補喂Trp、RPTrp對綿羊血漿Kyn含量的影響Table 7 Effects of Trp and RPTrp supplementations on plasma Kyn content of sheep (n=5) μmol/L
由表8可知,上午飼喂后,各組綿羊血漿5-HT含量均出現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢,均在8 h時達到峰值;10 h時,試驗Ⅱ組顯著高于對照組(P<0.05),試驗Ⅰ組與對照組和試驗Ⅱ組間差異均不顯著(P>0.05);下午飼喂后,0~6 h時,各組血漿5-HT含量緩慢升高,而在6~10 h升高較快,8 h時,試驗Ⅱ組顯著高于對照組和試驗Ⅰ組(P<0.05),而對照組和試驗Ⅰ組間差異不顯著(P>0.05)。
由表9可知,上午飼喂后,試驗組血漿ML含量在2~8 h呈持續(xù)增加趨勢,其中在6、8 h時,試驗組均極顯著高于對照組(P<0.01),試驗組間差異不顯著(P>0.05);對照組增加幅度較小。下午飼喂后,2~10 h時,試驗Ⅱ組血漿ML含量變化幅度最小,維持在87.19~98.34 pg/mL,在各采樣點均高于對照組和試驗Ⅰ組,其中在4、8 h時顯著高于對照組(P<0.05),試驗Ⅰ組與對照組間差異不顯著(P>0.05)。
表8 補喂Trp、RPTrp對綿羊血漿5-HT含量的影響Table 8 Effects of Trp and RPTrp supplementations on plasma 5-HT content of sheep (n=5) ng/mL
表9 補喂Trp、RPTrp對綿羊血漿ML含量的影響Table 9 Effects of Trp and RPTrp supplementations on plasma ML content of sheep (n=5) pg/mL
由表10可知,試驗組血漿GSH-Px活性極顯著高于對照組(P<0.01),而MDA含量極顯著低于對照組(P<0.01);試驗Ⅱ組血漿T-AOC極顯著高于對照組和試驗Ⅰ組(P<0.01)。
本試驗顯示,上午和下午補喂Trp或RPTrp后,與對照組相比,試驗Ⅰ組綿羊血漿T-Trp、F-Trp含量在2 h(10:00、22:00)時極顯著升高。研究表明,給羊瘤胃灌胃一定量放射性同位素[14C]標記吲哚環(huán)的Trp,10 min后即可在肝門靜脈血漿檢測到Trp,且在3 h內(nèi)有25%~70%會被吸收進入肝門靜脈[14]。試驗Ⅰ組血漿T-Trp和F-Trp含量在飼喂后0~2 h快速升高,可能與部分溶于瘤胃液的Trp隨瘤胃的蠕動快速過瘤胃有關(guān),也可能與本試驗中先將Trp與50 g精料混勻后飼喂有關(guān)。試驗Ⅱ組綿羊血漿T-Trp含量在飼喂后6 h(14:00)時顯著升高,F(xiàn)-Trp含量在飼喂后6(14:00)和4 h(00:00)時也顯著升高。Kollmann等[15]給奶牛添喂500 g/(d·頭)RPTrp(Trp含量為25%)后,白天和夜間血漿T-Trp含量均顯著提高;補喂6 g/(只·d) RPTrp(Trp含量為33%)可顯著提高遼寧絨山羊血漿T-Trp含量[8];以上研究均與本試驗結(jié)果基本一致。本試驗中,試驗Ⅰ組血漿T-Trp含量在飼喂后2~4 h(10:00—12:00、22:00—24:00)低于對照組,而試驗Ⅱ組變化幅度較小且高于對照組說明RPTrp有效避免在瘤胃中的降解[16]。下午飼喂后,試驗Ⅱ組血漿T-Trp含量高于對照組,但差異不顯著,與Kollmann等[15]研究結(jié)果不一致,這可能與綿羊采食時間和飼糧的組成有關(guān)。
表10 補喂Trp、RPTrp對綿羊血漿抗氧化能力的影響Table 10 Effects of Trp and RPTrp supplementations on plasma antioxidant capacity of sheep (n=5)
本試驗中,各組綿羊血漿FFA含量在白天和夜間均呈先降低后升高的變化趨勢,這是由于FFA在反芻動物消化道的吸收部位主要在空腸后3/4處,而在瘤胃內(nèi)吸收較慢。此外,研究表明,煙酸作為Trp代謝的主要產(chǎn)物之一,是一種抗脂類分解的物質(zhì)[17]。奶牛飼喂12 g/(頭·d)的煙酸,血漿FFA含量顯著降低[18]。本試驗中,試驗組血漿FFA含量降低可能與血漿煙酸含量升高有關(guān)。研究表明,血漿ALB分子性質(zhì)穩(wěn)定、幾乎不含Trp殘基[19],消除半衰期較長,為12.7~18.2 d[20],合成和降解機制復(fù)雜、尚未完全清楚[21]。有學(xué)者認為,血漿ALB含量主要受血漿膠體滲透壓的調(diào)節(jié)[22]。本試驗結(jié)果顯示,各組間血漿ALB含量無顯著性差異,說明補喂Trp或RPTrp對綿羊血漿ALB含量無顯著性影響。
本試驗中,補喂Trp或RPTrp后,綿羊血漿Kyn含量與T-Trp和F-Trp變化趨勢相似。這與成年健康男子口服Trp后血漿Kyn含量增加的研究結(jié)果一致[23]。哺乳動物體內(nèi)Trp約95%經(jīng)Kyn途徑代謝,主要由肝臟色氨酸-2,3雙加氧酶(tryptophan-2,3-dioxygenase,TDO)催化形成Kyn[24]。研究表明,大鼠腹腔注射100 mg/(kg BW·d) Trp后3 h,血漿F-Trp含量顯著增加,且肝臟中TDO活性顯著提高[25]。此外,飼糧中添加Trp后,仔豬肝TDO含量有增加的趨勢[26]。本試驗結(jié)果可能與綿羊肝臟TDO活性升高或含量增加有關(guān)。
本試驗中,上午飼喂后10 h(16:00)和下午飼喂后8 h(04:00),試驗Ⅱ組血漿5-HT含量顯著高于對照組,而試驗Ⅰ組與對照組在白天和夜間差異均不顯著。研究表明,5-HT是哺乳動物體內(nèi)Trp代謝的一個重要產(chǎn)物,血漿中5-HT主要由腸黏膜嗜鉻細胞(chromaffin cells,EC)產(chǎn)生和分泌[27],肥大細胞、胰腺β細胞、脂肪細胞和成骨細胞也可分泌少量5-HT[28],色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)是合成5-HT的關(guān)鍵酶。隨飼糧Trp含量的增加(0.11%~0.24%),仔豬血清5-HT含量顯著提高[29],這與本試驗結(jié)果一致。但也有學(xué)者證實,補喂RPTrp后泌乳奶牛血漿5-HT含量無顯著性升高[9],與本試驗結(jié)果不一致,這可能與泌乳奶牛腸黏膜EC中TPH活性較低或含量較少有關(guān)。研究表明,TPH的米氏常數(shù)(Km)約為50 μmol/L[30];其活性受底物Trp和輔酶四氫生物蝶呤等多種因素的影響[31];EC內(nèi)TPH含量較低或輔酶含量不足均抑制5-HT的合成與分泌。
本試驗中,上午飼喂后6~8 h(14:00—16:00)時,試驗組血漿ML含量極顯著高于對照組;下午飼喂后,試驗Ⅱ組均高于對照組和試驗Ⅰ組。研究表明,哺乳動物血漿ML在白天主要來自于腸黏膜嗜EC而夜間主要來自于松果體,存在明顯的晝夜節(jié)律[32-33]。給(22±3)月齡未妊娠瑞士褐牛添喂500 g/(頭·d)RPTrp(Trp含量為25%)后,白天血漿ML含量極顯著升高,而夜間顯著升高[15],這與本試驗結(jié)果一致。此外,前人研究表明,豬血漿ML含量最高值出現(xiàn)在上午飼喂后5 h,且與回腸、盲腸和結(jié)腸中ML含量呈顯著相關(guān)性[34]。本試驗中,上午飼喂后4~8 h(12:00—16:00),試驗組血漿ML含量呈增加趨勢,可能與綿羊回腸、盲腸和結(jié)腸中ML含量升高有關(guān)。本試驗未檢測綿羊腸道內(nèi)ML含量,今后可進一步研究血漿ML含量與腸道內(nèi)ML含量的關(guān)系。
本試驗中,試驗組血漿ML含量最高值均出現(xiàn)在上午飼喂后8 h(16:00),對照組出現(xiàn)在下午飼喂后2 h(22:00),并未表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律。這可能與以下原因有關(guān):其一,哺乳動物血漿ML含量具有明顯的季節(jié)變化規(guī)律,本試驗采樣當天日出時間為06:36,日落時間為21:53,晝長為15.27 h,長日照條件下,松果體內(nèi)ML合成關(guān)鍵酶N-乙酰轉(zhuǎn)移酶表達量降低[35],減弱了夜間松果體ML的分泌;其二,綿羊血漿ML含量具有顯著的個體差異[36],在夜間其雙側(cè)頸靜脈ML含量也具有顯著的差異[37]。
本試驗中,試驗組血漿GSH-Px活性和MDA含量與對照組相比差異均極顯著,試驗Ⅱ組還可極顯著提高血漿T-AOC。研究表明,斷奶仔豬飼糧中添加適量Trp可顯著提高血清T-AOC和降低MDA含量[26]。飼糧中添喂220 g/(d·頭)RPTrp(Trp含量為45%)可使奶牛血漿GSH-Px活性極顯著提高,與本試驗結(jié)果一致[9]。這是由于補喂Trp或RPTrp提高了血漿Trp和ML含量,Trp分子中的氨基可以與氧化劑結(jié)合,阻礙氧化反應(yīng)的發(fā)生,降低血漿MDA含量[38]。ML除直接發(fā)揮抗氧化作用外還可通過提高抗氧化酶活性發(fā)揮作用;此外,ML代謝產(chǎn)物N-乙?;?N-甲?;?5-甲氧基-犬脲胺和6-羥基褪黑素均具有更強的抗氧化作用[39]。
① 補喂Trp使綿羊采食后血漿T-Trp、F-Trp的含量迅速升高,Trp經(jīng)犬尿酸途經(jīng)代謝也迅速加快,而補喂RPTrp時上述作用則較平緩。
② 補喂Trp、RPTrp對綿羊血漿ALB、FFA、5-HT含量影響較小,僅有個別時間點作用顯著。
③ 補喂Trp、RPTrp使綿羊白天血漿中ML含量升高,補喂Trp對夜間綿羊血漿中ML含量沒有顯著影響,補喂RPTrp可使綿羊夜間血漿ML含量維持在相對較高的水平上。
④ 補喂Trp、RPTrp可提高綿羊血漿抗氧化能力。