高效液相色譜法測定飼料中那西肽A

林仙軍，陸春波，包愛情，王 彬

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州 311100）

那西肽（Nosiheptide）為淺黃綠褐色或黃綠褐色粉末，是一種帶有5個(gè)噻唑環(huán)的含硫多肽類 抗 生 素 （ 孫 小 青 ，2007） 其 分 子 式 為C51H43N13O12S6，相對分子質(zhì)量1222.36。那西肽能促進(jìn)豬（沈順新，2008）、雞生長（Cromwell，1984），提高飼料效率 （Benazet，1980a、b）。 按那西肽 A計(jì)算，混飼每1000 kg飼料，豬2.5～20 g，雞2.5 g（Yu，2009）， 廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中（Jiang，2015）。飼料中添加濃度較低的那西肽即能促進(jìn)畜禽生長 （Niu，2011）， 提高飼料效率（Wojtas，2016；Wang，2014；Pascal，1979）。

農(nóng)牧函 〔1998〕7號批準(zhǔn)那西肽及那西肽預(yù)混劑為國家三類新獸藥。農(nóng)業(yè)部第168號公告《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》將那西肽列為可在飼料中長時(shí)間添加使用的飼料藥物添加劑。農(nóng)業(yè)部公告第942號、第1204號、第1923號、第1960號和第2382號都涉及那西肽和那西肽預(yù)混劑的使用范圍、規(guī)格和檢測方法等內(nèi)容。

目前，那西肽的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（DB 34/T 1371-2011）、高效液相色譜紫外檢測法（張秀英，2013；段紅，2012；翟衛(wèi)紅，2011）、高效液相色譜熒光檢測法（林仙軍，2017；Horii，2000）和微生物檢定法等。微生物檢定法檢測成本低，操作較為簡便，一直是經(jīng)典的那西肽含量的檢測方法，目前《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)》（化學(xué)藥品、中藥卷）第一冊（農(nóng)業(yè)部公告1960號）仍然使用此法檢測。但由于微生物檢定法靈敏度較差，檢測周期長，不適宜批量檢測，滿足不了飼料中那西肽檢測需要。高效液相色譜法因其選擇性好、靈敏度高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)階段比較理想的選擇。農(nóng)業(yè)部公告第2382號，發(fā)布的那西肽發(fā)酵液干燥品配制的那西肽預(yù)混劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，采用高效液相色譜紫外檢測法測定那西肽組分，其中就明確指出那西肽的出峰順序?yàn)槟俏麟慕M分B、那西肽組分A，按峰面積歸一化法計(jì)算，那西肽組分A的峰面積不得少于那西肽組分A和那西肽組分B峰面積之和的88.0%。因此，那西肽A是主峰，本檢測方法只研究那西肽A。

由于那西肽在飼料中的添加量較低，因此，為了準(zhǔn)確測定飼料中那西肽的含量，我們前期研究的高效液相色譜熒光檢測法測定飼料中的那西肽，方法操作簡便，靈敏度高。但是，由于飼料基質(zhì)復(fù)雜，針對個(gè)別飼料存在加標(biāo)回收率不理想的情況，主要針對飼料中那西肽A測定的前處理方法和干擾因素等進(jìn)行了深入研究。通過實(shí)驗(yàn)得到了適用性更廣的前處理方法。配合飼料、濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料檢測限為0.2 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 那西肽對照品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號為 K0431212，按C51H43N13O12S6計(jì)，含量88.6%，每1mg相當(dāng)于928那西肽單位；乙腈、甲醇和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）等為色譜純；乙二胺四乙酸二鈉、乙醇、丙酮、三氯甲烷和磷酸氫二鈉等為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。Waters 2695-2475高效液相色譜儀 （配Empower 2軟件）；梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）XS-205 電子天平（精度為 0.01 mg）；上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司SL502 N電子天平（精度 0.01 g）；德國 Sigma公司 Sigma 3k30型冷凍離心機(jī)；昆山市超聲儀器有限公司KQ-500E型超聲波清洗器。

1.2 樣品處理 稱取配合飼料、濃縮飼料或添加劑預(yù)混合飼料2 g，精確至0.01 g，于50 mL離心管中，加入乙二胺四乙酸二鈉溶液1.0 mL，再加入N，N-二甲基甲酰胺19.0 mL，振搖使樣品完全分散、浸濕，置超聲波清洗器中超聲提取5 min，中間搖勻3次；取出，于10000 r/min離心5 min，過0.45μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測定。

1.3 液相色譜參考條件 色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；熒光檢測條件為激發(fā)波長327 nm，發(fā)射波長521 nm；流動相為 0.02%磷酸溶液+乙腈（60∶40，V/V）；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20μL。

1.4 線性相關(guān)實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取那西肽對照品適量，置于棕色容量瓶中，用適量DMF溶解，定容，搖勻，為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確吸取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用DMF稀釋成含那西肽為0.02、0.05、0.1、0.5、2.5、5.0、10.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。每個(gè)濃度進(jìn)樣2次，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 那西肽在水、乙醇、丙酮和三氯甲烷中不溶或微溶，在乙腈和DMF中溶解。取空白雞配合飼料2.0 g，添加那西肽，使其添加濃度分別為 0.5、2.0、5.0、10.0 mg/kg 和 50.0 mg/kg，分別加乙腈和DMF提取。結(jié)果兩種溶劑對于添加濃度不大于10 mg/kg的提取效果基本一致，回收率均在90%以上；對于添加濃度大于10 mg/kg的提取，DMF提取效果遠(yuǎn)好于乙腈；當(dāng)濃度為50 mg/kg時(shí)，乙腈提取的回收率只有60%左右?？赡艿脑蚴荄MF對那西肽的溶解性較乙腈相對較大。因此，選用DMF為提取劑，可達(dá)到充分提取的目的。

2.1.2 提取溶劑體積的選擇 以DMF作為提取溶劑，實(shí)驗(yàn)了以下幾種提取方法，10 mL+10 mL、20 mL+20 mL和20 mL。結(jié)果回收率均在90%以上。由于飼料本身占一定的體積，DMF不能濃縮，2次提取會導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確的問題。因此，為了準(zhǔn)確定量，便于操作，最后選擇20 mL一次提取的方案。提取方法簡單、快速。

2.1.3 初步確定的前處理方法及結(jié)果 稱取配合飼料、濃縮飼料或添加劑預(yù)混合飼料2 g，精確至0.01 g，于 50 mL 離心管中，加入 DMF 20.0 mL，振搖使樣品完全分散、浸濕，置超聲波清洗器中超聲提取5 min，中間搖勻3次；離心，過膜，測定。初步確定的前處理方法，對于少量隨機(jī)抽取的樣品，回收率結(jié)果較好。但加大樣本數(shù)量，發(fā)現(xiàn)配合飼料回收率符合要求，濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料有個(gè)別樣本回收率低。推測可能是飼料中金屬離子濃度太高，導(dǎo)致那西肽降解。后面進(jìn)行了模擬實(shí)驗(yàn)，添加高濃度的銅、鈣和鎂等離子，最后，排除了這種推測。

2.1.4 前處理方法的改進(jìn) 稱取回收率較低的濃縮飼料C、添加劑預(yù)混合飼料D和E進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取2.0 g，精確至0.01 g，于50 mL離心管中，加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液，再加入DMF。具體操作方法見表1。振搖使樣品完全分散、浸濕，置超聲波清洗器中超聲提取5 min，中間搖勻3次；取出，于10000 r/min離心 5 min，過 0.45μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測定。加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液和DMF提取體積對回收率的影響結(jié)果見圖1。

表1 乙二胺四乙酸二鈉溶液和DMF提取體m積L

圖1 乙二胺四乙酸二鈉溶液和DMF對回收率的影響

2.2 熒光檢測條件的確定 目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道液相色譜法測定那西肽的方法中，檢測器包括紫外檢測器和熒光檢測器兩種。紫外檢測器的波長包括330 nm（翟衛(wèi)紅，2011）和241 nm（段紅，2012），實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檢測靈敏度低，雜質(zhì)干擾比較嚴(yán)重，不能滿足檢測。本文參考文獻(xiàn)中的方法（林仙軍，2017；Horii，2000），采用熒光檢測器進(jìn)行檢測。將儀器的激發(fā)波長設(shè)定為200nm，發(fā)射波長掃描范圍暫設(shè)定為210～800nm，發(fā)現(xiàn)發(fā)射波長在521 nm處有最大吸收；將521 nm的波長作為發(fā)射波長固定下來，再做激發(fā)波長的掃描，激發(fā)波長的范圍要小于發(fā)射波長，發(fā)現(xiàn)激發(fā)波長在327 nm處有最大吸收。因此確定熒光檢測條件為激發(fā)波長327 nm、發(fā)射波長521 nm。

2.3 色譜柱的選擇 研究了不同色譜柱作為分離柱的效果，分別對Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱、Waters Atlantis C18（4.6 mm×250 mm，5.0μm） 柱、Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱等 3 種規(guī)格的色譜柱進(jìn)行了比較，結(jié)果表明分離結(jié)果均較為滿意。

2.4 流動相的選擇 在流動相選擇上，比較了磷酸鹽緩沖液-乙腈、磷酸溶液-乙腈和水-乙腈體系的色譜保留性能和靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸溶液/乙腈流動相體系的那西肽峰型最好、靈敏度最高。通過進(jìn)一步優(yōu)化磷酸溶液濃度和流動相配比，使那西肽獲得最佳峰型和保留時(shí)間，最終確定流動相為 0.02%磷酸溶液/乙腈為（60∶40，V/V），流速為1.0 mL/min。

2.5 線性考察、檢測限和定量限 取配制的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液進(jìn)樣檢測，以峰面積Y對濃度X（μg/mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以那西肽A峰得出回歸方程為 Y＝6.6176×105X-2.9747×104，相關(guān)系數(shù) R2為0.9999，那西肽A在0.02～10.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。當(dāng)飼料中添加那西肽A 為 0.5 mg/kg時(shí)，信噪比（S/N）大于 10，為定量限；當(dāng)飼料中添加那西肽A為0.2 mg/kg時(shí)，信噪比（S/N）大于 3，為檢測限。

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn) 分別取相應(yīng)的代表性飼料，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。每批次內(nèi)同一濃度做5個(gè)平行。典型色譜圖見圖2～圖8，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖2 對照品溶液（0.1μg/mL）色譜圖

圖3 濃縮飼料空白的高效液相色譜圖

圖6 配合飼料（添加濃度為1 mg/kg）色譜圖

圖7 預(yù)混合飼料空白色譜圖

圖8 預(yù)混合飼料（添加濃度為1 mg/kg）色譜圖

表2 不同飼料那西肽回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.7 抗干擾實(shí)驗(yàn) 為了研究本方法的專屬性，考察了目前養(yǎng)殖環(huán)節(jié)常用的藥物對那西肽分析的干擾，分別是鹽酸金霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、替米考星、氟苯尼考、阿莫西林、喹乙醇、乙酰甲喹、土霉素、恩諾沙星、林可霉素、4-差向金霉素以及多肽類抗生素黏菌素、恩拉霉素、桿菌肽鋅等15種藥物。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)品（對照品）約10 mg，用DMF溶解后，定容至200 mL，上機(jī)檢測。結(jié)果顯示，在該條件下以上藥物除恩諾沙星在保留時(shí)間約為2 min的時(shí)候出現(xiàn)色譜峰，其余藥物在該色譜條件下均未檢測出色譜峰，色譜圖見圖9。因此，對那西肽A檢測沒有干擾，表明本方法具有很強(qiáng)的專屬性。

2.8 那西肽降解因素考察 那西肽A作為多肽類抗生素，其貯藏條件要求密閉、陰涼干燥。那西肽A溶液在光照、高溫、堿、高濕、金屬離子和氧化等條件下易降解。取那西肽A標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）1.0 mL，置 100 mL 量瓶中，進(jìn)行室溫、避光、不避光、254 nm強(qiáng)光、4 ～20℃等保存24 h后測定。結(jié)果，24 h內(nèi)，溫度和日光照射影響較小；254 nm強(qiáng)光照射影響較大，下降了近50%。因此，在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)操作中要避免強(qiáng)光的照射。那西肽A在氫氧化鈉溶液中不穩(wěn)定，已降解完全，剩余那西肽A為0；在過氧化氫溶液中約降解10%；在鹽酸溶液中穩(wěn)定，幾乎沒有降解。因此，在樣品前處理時(shí)要綜合考慮，減少或避免這些不利因素的干擾，保證樣品檢測條件的一致性和穩(wěn)定性，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確。

圖9 抗干擾實(shí)驗(yàn)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（50 μg/mL）色譜圖

2.9 實(shí)際樣品檢測 采用建立的檢測方法對市場隨機(jī)抽取的配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料樣品各15份進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出2個(gè)，濃度分別為 20.6 mg/kg和 9.6 mg/kg。

3 結(jié)論

本文對飼料中那西肽A測定的前處理方法、色譜條件、影響因素和抗干擾因素進(jìn)行了研究。建立了飼料中那西肽A檢測的方法，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，配合飼料添加濃度為0.50～10.00 mg/kg時(shí)，平均回收率為89.5%～95.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.9%～5.5%；濃縮飼料添加濃度為0.50～100.0 mg/kg時(shí)，平均回收率為81.9%～88.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.5% ～8.9%；預(yù)混合飼料添加濃度為0.50～500.0 mg/kg時(shí)，平均回收率為81.6%～95.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.6%～5.5%。這表明用此方法檢測飼料中那西肽A的適用性更強(qiáng)了。