圍產(chǎn)期奶牛低血糖癥血液生化指標的診斷評價

張廣和， 李國鵬， 李心慰， 韓天龍,3， 劉國文

（1.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春130062；2.內蒙古赤峰市國營農(nóng)牧場綜合服務站，內蒙古赤峰 024000；3.赤峰市農(nóng)牧科學研究院，內蒙古赤峰 024031）

奶牛圍產(chǎn)期是指妊娠奶牛分娩前和分娩后的一段時期，一般指產(chǎn)前3周和產(chǎn)后3周共6～8周的時期，國外多稱之為過渡期。圍產(chǎn)期奶牛由于經(jīng)歷妊娠、分娩和泌乳三個階段的生理應激，體內代謝發(fā)生劇烈變化，尤其是干物質攝入不足導致的能量負平衡，使圍產(chǎn)期奶牛健康和繁殖生產(chǎn)遭受嚴重威脅。葡萄糖是反芻動物能量的主要來源，參與機體多種生理代謝過程，也是泌乳合成乳糖的重要物質來源。反芻動物葡萄糖合成主要由內源性生成和外源性吸收獲得，其中以內源性生成為主（妖軍虎，2013）。日糧提供的碳水化合物在瘤胃微生物作用下生成丙酸被瘤胃壁吸收轉至肝臟經(jīng)過一系列酶促反應最終進入血液供機體利用。所以血液中葡萄糖濃度變化對于了解機體能量變化情況是最直接的參考依據(jù)。奶牛低血糖癥是由眾多因素引起血糖濃度降到正常值外的一種臨床常見綜合征，低血糖主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內分泌腺、肝臟、胃腸、營養(yǎng)和運動調節(jié)。它是糖代謝紊亂的一個反應指標而不是疾病診斷的本質。本研究對圍產(chǎn)期奶牛低血糖發(fā)病率進行調查，目的是了解圍產(chǎn)期能量負平衡的嚴重程度以及發(fā)生疾病的預警，對于預測圍產(chǎn)期奶牛群體性能量負平衡提供參考；血液生化指標的監(jiān)測從能量、肝功能以及礦物質代謝方面了解圍產(chǎn)期奶牛低血糖癥發(fā)生的代謝情況，為早期疾病預防帶來參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物 本試驗選取吉林省長春市某奶牛場圍產(chǎn)期荷斯坦奶牛171頭，通過臨床癥狀、胎次、產(chǎn)奶量、體況評分（BCS）、干物質攝入量（DMI）和血液相關指標等，最終篩選出53頭奶牛為本試驗低血糖組奶牛。低血糖癥奶牛的判定標準是GLU＜2.5 mmol/L。選取53頭健康奶牛作為對照組。在發(fā)病率調查中，以周為時間單位，選取7個時間點，每個時間點不少于17頭奶牛。試驗組和對照組所有奶牛日糧均按NRC標準配制，采用舍飼，自由采食。

1.2 循環(huán)血液樣本的采集 根據(jù)場內管理系統(tǒng)記錄，計算奶牛預產(chǎn)期，選擇產(chǎn)前3周（-21 d）、2 周（-14 d）、1 周（-7 d）、分娩當天（0 d）和產(chǎn)后1周（7 d）、2 周（14 d）、3 周（21 d）7 個時間點的圍產(chǎn)期奶牛和健康奶牛，每頭奶牛血液樣品的采集均于清晨投飼前頸靜脈無菌采集20 mL。10 mL血液肝素鈉抗凝處理用做分離血漿，另10 mL血液不添加抗凝劑用做分離血清。分別于3800 g離心10 min，收集血漿（或血清）于事先準備好的無菌凍存管中，準確標記后，-80℃保存待測。

1.3 測定指標和方法 測定指標具體為：葡萄糖（GLU）、β-羥丁酸 （BHBA）、 非酯化脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG） 、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）、乳酸脫氫酶（LDH）、鈣（Ca）、鎂（Mg）和磷（P）。 采用常規(guī)生化試劑盒于吉林大學第四醫(yī)院醫(yī)學檢驗科測定，具體操作步驟按試劑盒使用說明書進行。具體檢測方法見表1。

表1 血液生化指標檢測方法

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行分析，組間差異顯著性采用one-way ANOVA進行分析，測定指標與NEFA、BHBA的相關性采用Bivariate Correlations皮爾遜檢驗分析，結果用“平均值±標準差”表示。

利用SPSS 19.0-ROC-Curve程序建立ROC曲線，比較各指標曲線下面積（Auc），并導出各指標分析結果中的敏感度和1-特異度值至Excel，利用公式：約登指數(shù)（Youden）＝敏感度-（1-特異度），計算YI最大值，其對應的檢測值即為cutpoint，其中Se表示正確判斷病牛的比率，Sp表示正確判定非病牛的比率，Se越高表明漏診幾率越小，Sp越高表明誤診概率越小。本研究以Se大于等于0.70作為具有診斷意義的可能下限。Auc＞0.5時，其值越大表明該指標的診斷準確性越高；Auc＜0.5時，則表明該指標無實際診斷價值。

2 結果

2.1 圍產(chǎn)期奶牛低血糖癥發(fā)病率調查 如圖1所示，從產(chǎn)前21 d奶牛低血糖發(fā)病率逐漸增加，分娩當天達到發(fā)病高峰（81.5%），產(chǎn)后逐漸降低，但至產(chǎn)后3周仍保持40%的發(fā)病率。

圖1 圍產(chǎn)期奶牛低血糖癥發(fā)病率調查

2.2 圍產(chǎn)期低血糖癥奶牛血液生化指標的改變及其與NEFA、BHBA相關性分析 從表2可知，與健康奶牛相比圍產(chǎn)期低血糖奶牛NEFA、BHBA、AST顯著升高 （P＜0.05或0.01），GLU和Ca顯著降低（P＜0.05或0.01），其他指標改變不大（P ＞ 0.05）。圍產(chǎn)期低血糖奶牛 GLU（r＝-0.597，P＝0.005）、Ca（r＝-0.490，v＝0.028）與 NEFA 呈顯著負相關，BHBA（r＝0.632，P＝0.003）與 NEFA 呈顯著正 相 關，GLU （r＝-0.629，P＝0.004）、NEFA （r＝-0.632，P＝0.003）與 BHBA 呈顯著負相關， AST（r＝0.704，P＝0.001）與 BHBA 呈顯著正相關。

2.3 高相關性血液生化指標在奶牛低血糖癥診斷中的效用評價及參數(shù)確定 如圖2，表3所示，利用ROC曲線分析，在奶牛低血糖癥診斷中高相關性血液生化指標的Auc分別為NEFA（0.721）、BHBA （0.674）、TG （0.621）、TBIL （0.351）、DBIL（0.459）、IBIL （0.319）、AST （0.522）、LDH （0.440）、Ca（0.018），其中 NEFA、BHBA、TG、AST 的 Auc面積大于0.5，具有診斷價值，利用Youden指數(shù)計算 cut-point 值 分 別 為 ：NEFA （Se∶0.642;1-Sp∶0.100）0.44mmol/L；BHBA （Se∶0.868;1-Sp∶0.500）0.34mmol/L；TG（Se∶0.472;1-Sp∶0.200）0.19mmol/L；AST（Se∶1.0;1-Sp∶1.0）53.00 IU/L。

表2 低血糖癥奶牛血液生化指標與NEFA、BHBA的相關性分析（n=53）

圖2 部分血液指標對奶牛低血糖癥診斷的ROC曲線比較

表3 部分血液指標在奶牛低血糖癥診斷中的靈敏度、1-特異度和臨界點

3 討論

對圍產(chǎn)期低血糖奶牛發(fā)病率做了調查，顯示產(chǎn)前3周至分娩當天發(fā)生率呈上升趨勢，分娩當天發(fā)生率最高，為81.5%，產(chǎn)后發(fā)生率逐漸降低至40%，仍保持較高發(fā)生率。說明奶牛在圍產(chǎn)期存在能量負平衡，與采食量下降，干物質攝入較少，能量來源不足致使葡萄糖（GLU）濃度下降有關。夏成等（2006）應用半定量RT-PCR方法測定了圍產(chǎn)期奶牛PEPCK-C mRNA的豐度，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前奶牛低血糖的發(fā)生與肝PEPEK-C mRNA豐度低有關，胰島素可抑制PEPCK-C轉錄啟動子，降低PEPCK-C基因的表達，減少肝糖異生。

圍產(chǎn)期低血糖奶牛與健康奶牛相比，NEFA差異顯著，表明低血糖組奶牛存在脂肪動員，使血液NEFA濃度升高。圍產(chǎn)期低血糖奶牛GLU（r＝-0.597，P＝0.005）、Ca （r＝-0.490，P＝0.028）與NEFA呈顯著負相關，表明在圍產(chǎn)期能量負平衡易發(fā)生低血糖及低鈣血癥。圍產(chǎn)期低血糖奶牛BHBA（r=0.632，P=0.003）升高，且與 NEFA 呈顯著正相關，進一步說明低血糖奶牛發(fā)生能量負平衡。圍產(chǎn)期低血糖奶牛GLU（r=-0.629，P=0.004）、NEFA（r=-0.632，P=0.003）與 BHBA 呈顯著負相關，AST（r=0.704，P=0.001）與 BHBA 呈顯著正相關，表明高BHBA與肝損傷有關。利用ROC曲線分析，在奶牛低血糖癥診斷中高相關性血液生化指標篩選出具有診斷價值的指標。

研究發(fā)現(xiàn)，妊娠后期奶牛肝臟葡萄糖凈通量為零，甚至為負數(shù)，泌乳初期肝臟葡萄糖總輸出量升高至妊娠后期的2.6倍，肝臟的糖異生作用在此起了最主要作用 （Piepenbrink， 等2003；Bell，1995）。血糖在機體中的代謝主要由神經(jīng)內分泌激素等調控，常見的有胰島素、胰高血糖素、腎上腺素、糖皮質激素、生長激素等（Bell，1995）。 當血糖濃度下降，胰高血糖素分泌增加，胰島素分泌減少，腎上腺素增加，機體對糖的吸收、轉運和代謝狀態(tài)主要體現(xiàn)在血糖的含量變化上。胰島素升高可幫助葡萄糖轉運進入細胞，降低細胞中cAMP的濃度，加強糖原的合成。胰島素與胰高血糖素比值的升高，可以表明機體合成代謝加強。隨著奶牛即將分娩生理狀態(tài)發(fā)生劇烈變化來適應分娩及泌乳需要，機體需要消耗大量的糖貯備，所以血糖呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。

4 結論

圍產(chǎn)期奶牛普遍存在低血糖，產(chǎn)前發(fā)病率高于產(chǎn)后。血糖濃度是低血糖癥的特異性指標，血液TBIL、DBIL、IBIL、AST、TG、LDH、Ca、P 可 作 為 低血糖癥的輔助性指標。本研究初步確定了低血糖癥輔助性指標的cut-point，為低血糖的監(jiān)測提供了參考數(shù)據(jù)。