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    花生AhFAD2—2基因的克隆與表達(dá)分析

    2018-08-14 09:42:06唐桂英王芳徐平麗單雷
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:不飽和花生脂肪酸

    唐桂英 王芳 徐平麗 單雷

    摘要:脂肪酸脫氫酶(FAD)能夠調(diào)節(jié)膜脂中不飽和脂肪酸的水平來提高植物對(duì)不良環(huán)境的耐受性。本研究利用RT-PCR方法從花生中克隆到2個(gè)脂肪酸脫氫酶基因,命名為AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。序列分析結(jié)果顯示,2個(gè)基因的ORF區(qū)均為1 152 bp,編碼383個(gè)氨基酸;cDNA水平上有12個(gè)堿基差異位點(diǎn),其中只有483位和720位的堿基差異引起氨基酸的改變;它們的基因組序列大小分別為5 089 bp和5 090 bp,在5′UTR區(qū)分別存在一個(gè)3 821 bp和3 822 bp的內(nèi)含子。qRT-PCR分析結(jié)果顯示,這兩個(gè)基因?yàn)榻M成型表達(dá),其中在葉片中的表達(dá)量最高,花和根中次之,莖與種子中表達(dá)量最低。低溫處理下,幼苗葉片中AhFAD2-2基因的表達(dá)量在0.5 h時(shí)迅速增加,至12 h達(dá)最高值,隨后表達(dá)量逐漸下降,說明AhFAD2-2的表達(dá)響應(yīng)低溫脅迫誘導(dǎo)。本研究結(jié)果可為花生的抗寒性遺傳改良提供理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:花生(Arachis hypogaea L.);AhFAD2-2基因;低溫脅迫;基因表達(dá)

    中圖分類號(hào):S565.2:Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2018)06-0027-08

    Abstract Fatty acid desaturase (FAD) can improve the stress tolerance of plants by regulating the contents of unsaturated fatty acids in membrane lipids. Two genes, named AhFAD2-2.1 and AhFAD2-2.2, encoding fatty acid desaturase were cloned from peanut by RT-PCR. Sequence analysis revealed that the ORF of both two genes were 1 152 bp, which encoded 383 amino acids. There were 12 different nucleotides between the two cDNA squences, among which, only the sites located at 483 and 720 lead to the differences at amino acid level. The gDNA sizes of the two genes were 5 089 bp and 5 090 bp, respectively. One 3 821-bp intron and one 3 822-bp intron were identified in the 5′UTR region of AhFAD2-2.1 and AhFAD2-2.2. The result of qRT-PCR showed that AhFAD2-2 was constitutively expressed, and the expression level was the highest in leaves, followed by flowers and roots, and the lowest in seeds. Under the low-temperature treatment, the expression level of AhFAD2-2 in peanut leaves increased significantly at 0.5 hour, reached the peak at 12 hour, and then decreased gradually. The results indicated that AhFAD2-2 might be responded to low temperature in peanut. This study could provide theoretical bases for the genetic improvement of cold resistance in peanut.

    Keywords Peanut (Arachis hypogaea L.); AhFAD2-2 gene; Low-temperature stress; Gene expression

    低溫是限制植物分布,影響植物生長發(fā)育的重要因素。當(dāng)環(huán)境溫度降低至不適宜植物生長的程度時(shí),植物細(xì)胞中的不飽和脂肪酸含量及其組成會(huì)發(fā)生改變,以維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性,降低逆境對(duì)膜結(jié)構(gòu)的損害,增強(qiáng)植物抗寒性[1,2]。因此,研究植物細(xì)胞中不飽和脂肪酸的代謝,對(duì)于闡明植物的抗寒機(jī)制具有重要意義。

    FAD2(fatty acid desatuase 2)是一種定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Δ-12去飽和酶[3-5],主要功能是催化單價(jià)不飽和脂肪酸C18∶1Δ9(油酸)在C12位脫氫,生成二價(jià)不飽和脂肪酸C18∶2Δ9,12(亞油酸)。大多數(shù)高等植物葉細(xì)胞中亞油酸(C18∶2Δ9,12)和亞麻酸(C18∶3Δ9,12,15)含量占脂肪酸總量的70%以上,非光合組織根與種子中所占比例也較高。盡管其他脂肪酸去飽和酶也參與了葉細(xì)胞中部分不飽和脂肪酸的合成,但大多數(shù)不飽和脂肪酸還是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的FAD2和FAD3催化合成,因此,F(xiàn)AD2一個(gè)最重要的功能是為整個(gè)植物體細(xì)胞中膜脂和儲(chǔ)藏脂的裝配提供所需的亞油酸,以及進(jìn)一步去飽和產(chǎn)生亞麻酸[6]。研究發(fā)現(xiàn),植物中存在兩類FAD2基因,一類主要在種子中表達(dá),參與儲(chǔ)藏脂中脂肪酸去飽和;另一類為組成型表達(dá),可能參與決定植物膜脂脂肪酸的不飽和程度,其活性對(duì)植物抗寒能力具有一定影響[7,8]。目前已經(jīng)在多種植物中分離出了FAD2基因,該基因受冷脅迫誘導(dǎo)。在低溫脅迫下,佛手香櫞葉的FAD2[9]、棉花葉的FAD2-3和FAD2-4[10]、油橄欖果實(shí)的FAD2-1和FAD2-2[7,11]及馬齒莧葉的FAD2-2的表達(dá)量隨著溫度的降低顯著升高[12]。在冷凍脅迫下,白楊PtFAD2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的存活率明顯比非轉(zhuǎn)基因株系和轉(zhuǎn)基因下調(diào)株系要高[13]。擬南芥fad2突變體缺乏脂肪酸脫氫酶活性,葉綠體膜中多不飽和脂肪酸含量顯著減少;在6℃條件下,植株生長受到抑制,最終枯萎、死亡[14]。

    本研究克隆到兩個(gè)新的AhFAD2-2基因,并進(jìn)一步利用qRT-PCR方法分析了它們在不同器官組織及在低溫脅迫下的表達(dá)情況,以期為該基因的功能及花生抗寒性研究提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 植物材料

    花生品種:魯花14號(hào),由本實(shí)驗(yàn)室保存,種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉試驗(yàn)田,用于根、莖、葉、花與種子的取材;低溫處理的材料種植在花盆中,選生長3周、長勢一致的花生幼苗,于8℃條件下處理0(對(duì)照組)、0.5、1、4、12、24、48 h以及恢復(fù)常溫處理6 h和24 h,取葉片。所取樣品于液氮中速凍,置-80℃冰箱貯存,用于RNA或DNA提取。

    1.2 菌株及質(zhì)粒

    大腸桿菌DH5α(Escherichia coli)和pEASY-T3克隆載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    1.3 試劑藥品

    限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit購自寶生物工程有限公司(大連);2×TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix和TransStart Green qPCR SuperMix UDG購自全式金生物技術(shù)有限公司(北京);凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自GENERAT生物技術(shù)有限公司(上海);TRIzol Reagent 購自賽默飛世爾科技公司(上海);PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;DNA序列測定由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測序中心完成;其余生化試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

    1.4 AhFAD2-2基因的cDNA和gDNA克隆

    以魯花14號(hào)幼嫩葉片為材料,分別利用Trizol 法和CTAB法[15]提取花生葉片總RNA和DNA;參照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit說明方法經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中ESTs拼接序列設(shè)計(jì)基因ORF(Open Reading Frame)區(qū)擴(kuò)增引物AhFAD2-2orfF和AhFAD2-2orfR,及基因組擴(kuò)增引物AhFAD2-2gDNA-F1和AhFAD2-2gDNA-R1(表1),PCR反應(yīng)體系:PCR Mix 10 μL,cDNA/gDNA 1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,總體積為20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min;然后94℃變性30 s,59℃復(fù)性30 s,72℃延伸1 min(gDNA為5 min),30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析后,用膠回收試劑盒回收目的片段,將回收產(chǎn)物連接到克隆載體pEASY-T3上,轉(zhuǎn)化并酶切驗(yàn)證后送山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測序中心測序。

    1.5 AhFAD2-2基因的序列分析

    利用http://web.expasy.org/protparam/ 在線分析AhFAD2-2基因編碼蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點(diǎn);蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)分析和信號(hào)肽分析分別利用TMHMM2.0軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TM-HMM/和Signal 4.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)進(jìn)行。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建利用MEGA5.0完成,采用Neighbor-Joining法,進(jìn)行1 000次Boot-strap分析。

    1.6 AhFAD2-2基因的表達(dá)模式分析

    以花生根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期種子,以及不同時(shí)段低溫處理花生的葉片為材料,提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈,利用熒光定量PCR方法,以qRT-PCR-FAD2-2F1和qRT-PCR-FAD2-2R1為引物,以UBI2為內(nèi)參基因(表1),反應(yīng)體系采用TransStart Green qPCR SuperMix UDG說明書中20 μL體系,每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。利用ABI 7500 PCR儀,采用2步法進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊?5℃ 10 min;第二步95℃ 10 s,60℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增曲線和Ct值由儀器自帶軟件自動(dòng)生成?;虮磉_(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 AhFAD2-2基因cDNA和gDNA克隆

    以魯花14號(hào)葉片cDNA為模板,利用特異性引物AhFAD2-2orfF和AhFAD2-2orfR擴(kuò)增到約1.1 kb的片段(圖1)。經(jīng)測序分析,獲得序列長度為1 152 bp的兩條cDNA序列,它們之間有12個(gè)堿基位點(diǎn)的差異,其中只有483位和720位的堿基差異導(dǎo)致了氨基酸水平上的不同。將其分別命名為AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。

    以特異性引物AhFAD2-2gDNA-F1和AhFAD2-2gDNA-R1擴(kuò)增AhFAD2-2基因的gDNA序列,得到一段約5 kb的產(chǎn)物(圖2)。經(jīng)測序分析,得到兩條長度分別為5 089 bp和5 090 bp的序列。

    2.2 AhFAD2-2基因及編碼氨基酸序列分析

    AhFAD2-2基因序列分析表明,兩基因ORF區(qū)均為1 152 bp,編碼383個(gè)氨基酸,推測相對(duì)分子量分別為43 839.27和43 829.29,等電點(diǎn)均為8.80。兩基因gDNA長度分別為5 089 bp和5 090 bp,5′UTR區(qū)分別包含一個(gè)3 821 bp和3 822 bp的內(nèi)含子。

    利用NCBI網(wǎng)站中CDD(Conserved Domain Database)數(shù)據(jù)庫對(duì)AhFAD2-2蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果表明,AhFAD2-2蛋白中含有保守結(jié)構(gòu)域Membrance-FADS-like。此結(jié)構(gòu)域?yàn)镕AD超家族所共有的,推測該蛋白是FAD家族成員(圖3)。

    以TMHMM2.0分析AhFAD2-2氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)在49~71、81~103、176~198、223~243和250~272氨基酸處存在著5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖4),且每兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的距離較短。通過亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)AhFAD2-2蛋白結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。利用SignalP 3.0軟件分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號(hào)肽結(jié)構(gòu),推測AhFAD2-2編碼的蛋白質(zhì)不是分泌蛋白。

    運(yùn)用PROSITE數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)花生FAD2-2氨基酸序列的105~111、141~147位和315~321位有3個(gè)高度保守的組氨酸簇,分別為HECGHH、HRRHH、HVAHH(圖5)。研究表明,在FAD2家族中,這3個(gè)組氨酸簇是FAD2蛋白發(fā)揮功能必不可少的活性位點(diǎn),同時(shí)還被預(yù)測為鐵原子的配體。相鄰組氨酸簇之間的距離也是一定的,這一特點(diǎn)在其他物種FAD2蛋白中也存在[16]。

    將AhFAD2-2氨基酸序列與已知的其他物種FAD2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)。植物中FAD2基因主要分為兩類,一類是組成型表達(dá)的FAD2,一類是種子特異性表達(dá)的FAD2。不同物種FAD2氨基酸序列分析顯示,與花生AhFAD2-2聚在一支的均屬于組成型表達(dá)的FAD2。其中,AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2分別與來源于B基因組和A基因組的野生種花生FAD2-2親緣關(guān)系最近;其次與大豆GmFAD2-2(Glycine max,L29215)、棉花GhFAD2-2(Gossypium hirsutum,Y10112)和檸條錦雞兒CkFAD2(Caragana korshinskii,ABP49577.1)的親緣關(guān)系較近,而與擬南芥AtFAD2(Arabidopsis thaliana,NP_187819.1)、油菜BnFAD2(Brassica napus,AAF78778.1)、向日葵HaFAD2(Helianthus annuus,OTG00389.1)親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)?;ㄉ鶤hFAD2-2與AhFAD2A、AhFAD2B聚在不同分支,后者屬于種子特異性表達(dá)FAD2,說明AhFAD2-2是不同于花生AhFAD2A和AhFAD2B的另一類基因。

    2.3 AhFAD2-2基因表達(dá)分析

    以UBI2為內(nèi)參基因,對(duì)AhFAD2-2基因在根、莖、葉、花、不同發(fā)育時(shí)期種子以及低溫處理不同時(shí)段葉片中的表達(dá)模式進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示,在花生的根、莖、葉、花和種子中均有AhFAD2-2基因表達(dá),但在不同組織中表達(dá)量有所差異。葉中的表達(dá)量最高,其次是花和根,在莖和種子中該基因的表達(dá)量最低(圖7)。并且發(fā)育前期種子內(nèi)表達(dá)量明顯高于后期(圖8)。推測花生AhFAD2-2基因編碼的蛋白可能在膜脂的脫飽和代謝中發(fā)揮作用。

    低溫脅迫的葉片中,處理0.5 h時(shí)AhFAD2-2表達(dá)量迅速升高,隨著處理時(shí)間的逐漸延長,表達(dá)量逐漸增加,處理12 h時(shí)表達(dá)量最高;之后表達(dá)量表現(xiàn)為下降趨勢,但在48 h后表達(dá)量明顯高于對(duì)照未處理組?;謴?fù)常溫后表達(dá)水平略微降低(圖9)。表明AhFAD2-2顯著響應(yīng)低溫脅迫處理。

    Gm:大豆Glycine max;Ck:檸條錦雞兒Caragana korshinskii;Mt:苜蓿Medicago truncatula;Ca:鷹嘴豆Cicer arietinum;Ah:花生Arachis hypogeae; Ai:野生花生Arachis ipaensis;Ad:野生花生Arachis duranensis;Cc:木豆Cajanus cajan;Tm:旱金蓮Tropaeolum majus;Hb:風(fēng)車藤Hiptage benghalensis;Rc:蓖麻Ricinus communis;Pt:毛白楊Populus tomentosa;Lu:亞麻Linum usitatissimum;Pl:芍藥Paeonia lactiflora;So:菠菜Spinacia oleracea;Po:馬齒莧Portulaca oleracea;Pc:荷蘭芹Petroselinum crispum;Cp:Crepis palestina;Ct:紅花Carthamus tinctorius;Vg:斑鳩菊Vernonia galamensis;Ha:向日葵Helianthus annuus;Co:金盞花Calendula officinalis;Oe:油橄欖Olea europaea;Vf:油桐Vernicia fordii;Pg:石榴Punica granatum;Gh:陸地棉Gossypium hirsutum;Mp:水黃皮Millettia pinnata;Pam:鱷梨Persea americana;Bo:琉璃菊Borago officinalis;At:擬南芥Arabidopsis thaliana;Bc:埃塞俄比亞芥Brassica carinata;Bj:芥菜型油菜Brassica juncea;Bn:油菜Brassica napus;Br:蕪菁Brassica rapa。

    3 討論與結(jié)論

    目前的研究發(fā)現(xiàn),許多植物中存在多個(gè)拷貝的FAD2基因,且不同拷貝具有不同的表達(dá)模式,可將它們分為組成型表達(dá)和種子特異性表達(dá)兩類[17]。如向日葵HaFAD2-1和大豆FAD2-1A、FAD2-1B在發(fā)育的種子中特異表達(dá),而HaFAD2-2、HaFAD2-3和大豆FAD2-2為組成型表達(dá),由此推測它們在不同部位的表達(dá)與功能是密切相關(guān)的[18,19]。在紅花中發(fā)現(xiàn)的11個(gè)拷貝的FAD2基因也驗(yàn)證了這一推測[20]。目前,本課題組在花生中克隆到4個(gè)拷貝的FAD2基因,分別是AhFAD2(AhFAD2A和AhFAD2B)以及AhFAD2-2(AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2)。AhFAD2A和AhFAD2B主要在種子中表達(dá),參與花生種子儲(chǔ)藏脂中不飽和脂肪酸的合成[21]。本研究中克隆到的AhFAD2-2,在系統(tǒng)進(jìn)化樹中與AhFAD2A和AhFAD2B聚在不同分支,距離較遠(yuǎn);而與組成型表達(dá)的一類基因聚在一起,其中該分支中研究較多的大豆GmFAD2-2、棉花GhFAD2-2的表達(dá)響應(yīng)低溫脅迫,可能參與膜脂不飽和脂肪酸的合成。說明AhFAD2-2是花生中新的一類脂肪酸去飽和酶FAD2。

    植物通過脂肪酸去飽和酶引入雙鍵,調(diào)節(jié)生物膜膜脂不飽和脂肪酸的水平,改變生物膜的流動(dòng)性,從而響應(yīng)并適應(yīng)低溫環(huán)境。大量研究證明,膜脂脂肪酸不飽和度主要取決于FAD的種類和數(shù)量[17]。油菜硬脂酰ACP去飽和酶(stearoyl-ACP desaturase)基因SAD受低溫誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著升高,冬性抗寒品種SAD上調(diào)幅度明顯高于春性冷敏感品種[22]。大豆中FAD2-2C基因的表達(dá)量明顯受到低溫環(huán)境的影響,生長在溫度較低條件下大豆的FAD2-2C表達(dá)量比對(duì)照提高了8倍[23]。Kargiotidou等對(duì)棉花組成型表達(dá)基因FAD2-3和FAD2-4研究時(shí)發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)基因的表達(dá)水平均受低溫脅迫誘導(dǎo),并且葉片中二價(jià)不飽和脂肪酸的種類與含量也顯著增加[10]。將番茄的LeFAD3基因超表達(dá),4℃處理的轉(zhuǎn)基因番茄幼苗中,LeFAD3基因的轉(zhuǎn)錄水平大幅升高,葉和根中C18∶3顯著增加,C18∶2顯著降低,且葉綠體膜系統(tǒng)中的超微結(jié)構(gòu)比對(duì)照完整性好,PSⅡ最大光合效率也明顯高于對(duì)照[24]。這些研究表明,脂肪酸脫氫酶在植物低溫脅迫響應(yīng)中起重要作用。本研究中AhFAD2-2的表達(dá)增強(qiáng)與低溫脅迫具有明顯相關(guān)性,推測該基因參與花生抗寒反應(yīng),但其抗低溫脅迫的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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