小葉錦雞兒內(nèi)生拮抗菌株的篩選與分子鑒定

李志英 田岳娟 徐惠娟 代金霞

摘要：采用抑菌圈法對(duì)分離自寧夏荒漠草原固沙植物小葉錦雞兒的27株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行植物病原菌抑制能力的測(cè)定。結(jié)果表明，小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力較強(qiáng)，多數(shù)菌株對(duì)2種以上的病原菌表現(xiàn)出拮抗活性，且不同菌株之間以及同一菌株對(duì)不同病原菌間的拮抗活性存在很大差異，有7株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)所有供試病原菌都表現(xiàn)出一定的抑制活性。通過16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，小葉錦雞兒內(nèi)生拮抗菌株分別與芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、羅爾斯通氏菌屬、中華根瘤菌屬具有很高的同源性，這些菌株多數(shù)為芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：小葉錦雞兒；內(nèi)生菌；抑菌活性；分子鑒定

中圖分類號(hào)： Q939.92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0105-02

收稿日期：2013-09-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31200103）；寧夏自然科學(xué)基金（編號(hào)：NZ12152）。

作者簡(jiǎn)介：李志英（1977—），女，寧夏青銅峽人，博士，講師，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。E-mail：lizhiying_1115@163.com。

通信作者：代金霞，女，寧夏銀川人，博士，副教授，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。E-mail：djxia05@163.com。植物內(nèi)生菌（endophyte）是指生長(zhǎng)在健康植物組織、器官內(nèi)部，而又不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群[1]。植物內(nèi)生菌長(zhǎng)期生存于植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與宿主協(xié)同進(jìn)化，一方面植物體為其提供生長(zhǎng)所必需的能量和營(yíng)養(yǎng)，另一方面，內(nèi)生菌又可以通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)植物體產(chǎn)生影響[2]。許多植物內(nèi)生細(xì)菌具有多方面的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)功能，如固氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抗逆境、抗病蟲害和生物修復(fù)等。

植物病害是引起植物品質(zhì)下降、產(chǎn)量損失的主要原因之一，約80%的植物病害是由植物病原菌引起的。目前，對(duì)植物病害的主要防治手段是采用化學(xué)農(nóng)藥，而化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人畜的副作用以及殘留問題、環(huán)境污染問題已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟需解決的主要問題。植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生眾多的抗菌產(chǎn)物并在一定條件下成為植物病原菌的拮抗菌，卻不會(huì)引起宿主植物明顯的病癥，目前從植物體內(nèi)篩選對(duì)植物病原菌具有抑制作用的拮抗內(nèi)生菌并進(jìn)行生物防治已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[3]。

小葉錦雞兒（Caragana microphylia Lam.）為豆科蝶形花亞科錦雞兒屬植物，具有廣泛的適應(yīng)性和極強(qiáng)的抗逆性，是中國(guó)西北、華北、東北西部水土保持和固沙造林的重要樹種之一。小葉錦雞兒在維護(hù)干旱荒漠區(qū)的生態(tài)平衡、改善沙區(qū)環(huán)境、發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)、提高沙區(qū)的經(jīng)濟(jì)效能中發(fā)揮著十分重要的作用[4]。

本試驗(yàn)通過對(duì)小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌抑制植物病原菌的能力進(jìn)行測(cè)定，試圖篩選出具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。研究結(jié)果不僅可為開發(fā)生物農(nóng)藥提供菌種資源，同時(shí)也將為豐富我國(guó)的微生物資源、推動(dòng)干旱地區(qū)微生物資源的保護(hù)、開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株分離自寧夏荒漠固沙植物小葉錦雞兒的各部分組織中，根據(jù)培養(yǎng)形態(tài)選取其中的27株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，菌種編號(hào)分別為：R05、R09、R10、R12、R14、R18、R41、R43、R44、R46、R47、R48、L01、L02、L05、L10、L12、L13、L15、L16、L17、L18、L19、L20、S01、S03、SD3。指示病原菌為：小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici）、番茄炭疽病菌（Colletotrichum lycopersici）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、馬鈴薯干腐病菌（Fusarium solani）、蘿卜黑斑病菌（Alternaria sp.），均來源于寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理室。

1.2內(nèi)生菌的分離與純化

各稱取1 g小葉錦雞兒的根、莖、葉，表面消毒后置于滅菌研缽中研磨；將磨碎的組織加到含有滅菌生理鹽水和滅菌玻璃珠的錐形瓶中，渦旋振蕩1 min；將上清液倒入滅菌離心管中沉淀后，再將上清液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋率分別為10-1、10-2、10-3，各取0.1 mL涂LB平板，每個(gè)處理重復(fù)3次；同時(shí)取0.1 mL最后一次沖洗的無菌水涂平板，作為表面滅菌對(duì)照。將所有平板于28 ℃培養(yǎng) 72 h，挑取平板上的單菌落進(jìn)行劃線分離，直至得到純的單菌落并保存在斜面上備用。

1.3抑菌能力的測(cè)定

采用LB固體培養(yǎng)基抑菌圈法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。用接種環(huán)分別挑取純化好的內(nèi)生菌單菌落接入裝有20 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng) 48 h，取出后用無菌水調(diào)至D值一致。將指示病原菌接入PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，無菌過濾后取上清備用。

采用對(duì)峙培養(yǎng)法，取200 μL指示病原菌濾液并用無菌玻璃棒均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，干燥后用滅菌打孔器對(duì)稱打4個(gè)孔，取35 μL內(nèi)生菌發(fā)酵液滴于孔中，置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)，每處理各3個(gè)重復(fù)。從培養(yǎng)第1天開始觀察菌落生長(zhǎng)情況，并記錄內(nèi)生菌形成的透明圈直徑。抑菌能力通過計(jì)算內(nèi)生菌菌落形成的透明圈直徑與孔直徑的比值（D/d值）來評(píng)價(jià)：D/d值越大，抑菌能力越強(qiáng)；比值越小，抑菌能力越弱；比值為1時(shí)表示菌落無抑菌能力。

1.4菌株的分子鑒定

將篩選出的具有較強(qiáng)抑菌能力的菌株進(jìn)行總DNA的提取。采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F、1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[5]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行16S rDNA全序列的測(cè)定，將所測(cè)序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性搜索，以確定菌株的分類地位。

2結(jié)果與分析

2.1小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性

，分離的27株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)供試病原菌的抑菌能力差別較大，有6株內(nèi)生菌對(duì)供試的所有病原菌均未表現(xiàn)出抑菌活性，而多數(shù)菌株對(duì)2種以上的病原菌表現(xiàn)出抑制活性。此外，同一菌株對(duì)不同病原菌的抑制能力也存在很大差異，如R10對(duì)番茄枯萎病菌和番茄炭疽病菌的抑制能力很強(qiáng)，但對(duì)蘿卜黑斑病菌卻無抑菌活性；L17、R18對(duì)蘿卜黑斑病菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性，但對(duì)番茄炭疽病菌的抑菌活性卻很低。從整體上看，小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力較強(qiáng)，R43、L01、L02、L05、L16、L20、S03等7株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)所有供試病原菌都表現(xiàn)出一定的抑制活性。

2.2內(nèi)生細(xì)菌的鑒定結(jié)果

將篩選出的具有較強(qiáng)抑菌活性的內(nèi)生菌16S rDNA序列與GenBank中的同源序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，這些菌株分別與芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobum）的細(xì)菌具有很高的同源性（表2），且多數(shù)菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌抑菌能力的測(cè)定結(jié)果

菌種

編號(hào)透明圈直徑/孔直徑（D/d值）番茄枯

萎病菌番茄炭

疽病菌玉米大

斑病菌小麥赤

霉病菌馬鈴薯干

腐病菌蘿卜黑

斑病菌R051.381.001.002.761.001.28R091.001.002.951.731.001.50R103.864.672.572.812.381.00R121.001.001.001.001.001.00R143.122.241.003.571.002.38R182.151.001.002.242.278.39R411.001.001.001.001.001.00R432.672.052.335.052.675.67R441.001.001.002.111.004.00R461.001.001.001.001.001.00R473.141.003.103.332.093.00R481.001.001.001.712.544.95L012.382.091.714.002.626.15L022.131.672.003.252.237.17L053.574.333.812.332.221.91L101.001.001.001.001.001.00L121.001.001.001.001.001.00L131.731.001.002.832.257.22L152.252.452.001.002.501.00L162.722.362.954.252.22 6.92L171.731.002.113.381.959.43L181.001.001.001.001.001.00L192.273.763.142.382.181.00L202.352.763.336.002.188.33S013.674.572.763.051.821.00S033.194.383.713.482.582.50SD33.144.483.522.482.271.00

內(nèi)生菌的16S rDNA的鑒定結(jié)果

菌株NCBI比對(duì)結(jié)果序列相似性

（%）R43，L01，L16Bacillus cereus100Bacillus thuringiensis100Bacillus subtilis100L19，R18Bacillus pumilus100L17Bacillus simplex100R10 Bacillus idriensis100R14，R47Paenibacillus ehimensis99S01Pseudomonas syringae97L02，L05，L20 Ralstonia pickettii100S03Sinorhizobum melioti100

3結(jié)論

植物體可以看作是被許多不同細(xì)菌開發(fā)的不同生境的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)。在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，不同的內(nèi)生菌可以占據(jù)不同的生態(tài)位，它們相互作用并在植物體內(nèi)維持著微生態(tài)平衡。植物內(nèi)生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應(yīng)用潛力，是個(gè)潛力巨大、尚待開發(fā)的微生物新資源。本研究運(yùn)用抑菌圈法對(duì)小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌拮抗植物病原菌的能力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明， 多數(shù)菌株對(duì)不同的病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制能力。經(jīng)16S rDNA序列分析表明，多數(shù)具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌屬的一些種類對(duì)外界有害因子的抵抗力強(qiáng)，菌體生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的枯草菌素、制霉菌素等多種活性物質(zhì)對(duì)植物病原菌有明顯的抑制作用[6]。蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis由于能產(chǎn)生δ內(nèi)毒素，對(duì)鱗翅目等昆蟲的幼蟲有毒殺作用而被用以制造生物農(nóng)藥，是常用的生防資源菌[7]。芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬的許多菌株不僅可以分泌吲哚乙酸或赤霉素等，從而有效促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，而且能抑制多種病原菌的活性，從而顯著提高植物的抗病性。

作為防風(fēng)固沙的先鋒物種，小葉錦雞兒的生態(tài)學(xué)意義遠(yuǎn)大于其經(jīng)濟(jì)學(xué)意義，發(fā)掘與其共生的微生物資源不僅對(duì)探索極端環(huán)境中內(nèi)生細(xì)菌-宿主植物的協(xié)同進(jìn)化研究有著重要的指導(dǎo)意義，而且有助于我們更加透徹地認(rèn)識(shí)其共生體系的形成及抗逆機(jī)理。期待能夠從研究中找到增強(qiáng)小葉錦雞兒抗逆性的合適途徑，進(jìn)而對(duì)沙漠化的治理起到積極的作用。

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