水稻新品種玉稻518灌漿期POD動態(tài)分析

， ， ， ， ，

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453000)

過氧化物酶(peroxidase，POD)是植物中廣泛存在的一種氧化還原酶，它以過氧化氫為電子親本催化底物氧化，參與體內(nèi)活性氧的清除，在植物呼吸作用、光合作用以及抗逆等過程中起到重要作用。該酶在植物不同生長發(fā)育階段的活性和種類，受到遺傳物質(zhì)直接調(diào)控和環(huán)境因素影響，因此可通過POD酶譜特征來分析某些表觀性狀的遺傳變化[1-3]。

離子束誘變育種技術(shù)，是通過低能離子束輻照，使植物產(chǎn)生可遺傳的變異，后經(jīng)人工多代選擇，培育植物新品種的一種育種方法[4-5]。在20世紀(jì)80年代，國內(nèi)科研人員首先將低能離子束應(yīng)用于水稻誘變育種，發(fā)現(xiàn)誘變后代中具有高突變率和寬突變譜的特點[6]，隨后該技術(shù)普遍應(yīng)用在作物誘變育種研究[7-9]。李金亭等[10]采用離子束注入蘿卜，對誘變蘿卜的幼苗POD進行電泳分析，發(fā)現(xiàn)真葉期POD酶譜出現(xiàn)1條Rf 0.61的酶帶，減少1條Rf 0.22的酶帶，證明離子注入能影響POD的表達；徐家萍等[11]采用離子束誘變雞桑，提取芽中POD同工酶進行電泳分析，發(fā)現(xiàn)誘變后代與親本在過氧化物同工酶酶譜及RAPD指紋上均存在差異，初步從分子水平證實離子束誘變能獲得新的種質(zhì)資源。趙俊杰等[12]對N+離子注入的小麥種子萌發(fā)期POD同工酶進行研究，發(fā)現(xiàn)根中POD同工酶檢出一條新酶帶，推測是離子注入引起POD同工酶基因表達改變。

以往關(guān)于水稻離子束誘變育種同工酶方面的研究，大多集中在對低代誘變材料的POD變化進行分析，對離子束誘變選育出的水稻新品種(指已穩(wěn)定遺傳且綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的通過國家或省級作物品種審定的新品系)POD酶譜變化及與農(nóng)藝性狀關(guān)系的研究還未見報道。為了解離子束誘變的水稻品種POD酶譜變化及與性狀的關(guān)系，采用蛋白質(zhì)復(fù)性電泳技術(shù)對離子束誘變的水稻新品種玉稻518及親本在灌漿期的POD酶譜動態(tài)變化進行了研究，旨在發(fā)現(xiàn)離子束誘變引起的水稻灌漿期酶譜的變化情況，以及與變異性狀間的關(guān)系，為水稻離子束誘變育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

2004年對親本新稻03518(用A表示)進行離子束誘變，經(jīng)多代自交選育得到穩(wěn)定遺傳的新品系M 03518，于2015年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會審定(國審稻2015044)，品種名：玉稻518(用B表示)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品制備

實驗材料統(tǒng)一于2017年5月1日育秧，6月3日移栽于土壤肥力一致的同一試驗田(河南師范大學(xué)生物試驗田)，田間管理按常規(guī)大田措施。待水稻生長至灌漿期分3次取樣，分別在灌漿前期、中期、后期。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)選5株，每株取倒2葉片，迅速置于冰盒中帶回實驗室。用去離子水沖洗干凈，吸干水，去除葉脈后保留中間1 cm葉片，5份剪碎混合稱量相同鮮重，置于預(yù)冷研缽中液氮充分研磨，然后加入4倍體積(W/V=1/4)提取液(0.9% NaCl溶液)繼續(xù)研磨至勻漿液，轉(zhuǎn)移至離心管冰浴浸取5 min，4 ℃離心(10 000r/min)10 min，取上清液分裝到200μL離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?，以上操作均? ℃環(huán)境進行。

1.2.2 復(fù)性電泳

復(fù)性電泳技術(shù)(SDS-G-PAGE)[13]采用過飽和SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生可逆變性，然后進行電泳，電泳后用非離子去垢劑洗去與蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS，使其恢復(fù)活性。然后用聯(lián)苯胺染色，便可直觀的分析POD酶譜變化。

聚丙烯酰胺凝膠復(fù)性電泳按照Neuhaus-Steinmetz等[13]的方法(略有改動)，電泳采用10%分離膠和5%濃縮膠，樣品制備液中加入活性樣品緩沖液，混勻備用。每泳道上樣量為30μL。電泳按照Heussen等[14]和徐存栓[15]等的方法，濃縮膠電壓≤80 V，電流≤20 mA，分離膠電壓≤120 V，電流≤20 mA，-4 ℃環(huán)境電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)距離分離膠下沿1～2 cm時停止電泳，取出分離膠，切除溴酚藍(lán)以下部分，放入250 mL洗滌液(TritonX-100 12 mL，Tris-base 3.03 g，加雙蒸水500 mL，調(diào)pH=7.0)洗滌30 min，再用雙蒸水洗滌3次，每次5 min。

1.2.3 染色及照相

采用聯(lián)苯胺染色法(雙蒸水200 mL+聯(lián)苯胺母液20 mL+1.5 M醋酸鈉10 mL+1.5 M醋酸10 mL，3%的H2O220 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配)進行染色，條帶清晰后立即拍照。由于酶活有差異，本實驗分2次拍照，即著色速度快的酶帶清晰時第1次拍照，繼續(xù)染色至其它酶帶清晰時第2次拍照。然后，將膠板保存于7%乙酸中或制成干膠。標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道在洗滌前單獨切下，固定，考馬斯亮藍(lán)染色液染色，然后脫色，照相。

1.2.4 酶譜分析

利用Gel Pro軟件(美國Media Cybernetics公司)標(biāo)注分析各泳道酶帶分子量和酶活。

1.3 主要試劑及配方

丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺貯存液：稱取丙烯酰胺(Acry)150 g，甲叉雙丙烯酰胺(Bir)4 g，加入2 g活性炭溶解1 h，過濾定容至500 mL，4 ℃保存。

1.5 M Tris-HCl(pH=8.8)：三羥甲基氨基甲烷36.28 g，SDS 0.8 g，鹽酸調(diào)pH至8.8，定容至200 mL。

0.5 M Tris-HCl(pH=6.8)：三羥甲基氨基甲烷12.11 g，SDS 0.8 g，鹽酸調(diào)pH至6.8，定容至200 mL。

電極緩沖液(10 X電極緩沖液)：Gly 72.2 g+Tris 15.41 g+SDS 5 g，溶解后雙蒸水定容至500 mL保存?zhèn)溆?，注意?jīng)常更換。

活性樣品緩沖液(3 X樣品緩沖液)：78%甘油20 mL，0.5 M Tris-HCl(pH=6.8)7 mL，SDS 10 g，雙蒸水定容至200 mL。

固定液：甲醇250 mL，冰乙酸50 mL，雙蒸水200 mL。

染色液：考瑪斯亮藍(lán)R 250 1.1 g，甲醇200 mL，冰乙酸50 mL，雙蒸水250 mL。

脫色液：甲醇150 mL，冰乙酸50 mL，雙蒸水300 mL。

洗滌液：TritionX-100 12 mL，Tris 3.03 g，完全溶解后調(diào)pH至7.0，定容500 mL。

聯(lián)苯胺母液(10 x)：2 g聯(lián)苯胺+100 mL無水乙醇，溶解后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker：245、180、135、100、75、63、48、35、25、20 kD。

注：A.新稻03518；B.玉稻518；1、2、3分別代表灌漿前期、中期、后期；M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker。下同。圖1 玉稻518及親本灌漿期葉片POD酶譜

圖2 玉稻518及親本灌漿期葉片300～100 kD區(qū)域POD酶譜(高酶活區(qū)顯色早期放大圖)

2 結(jié) 果

2.1 灌漿前期酶譜

由圖1的A 1和B 1泳道可以看出，在灌漿前期，A 1、B 1中均檢出300～100 kD酶活極強的帶區(qū)，以及48、38、36、34、33、31 kD和27 kD等7條酶帶，其中48 kD和36 kD酶活較強，其它酶帶活性較弱；上述各酶帶在A 1中酶活均高于B 1，兩泳道總酶活A(yù) 1>B 1。B 1中還檢出54 kD和42 kD 2條新酶帶，活性較弱，A 1中未檢出。由圖2可知，在B 1中，檢出185 kD新酶帶，且活性較弱，A 1中未檢出。A 1、B 1中均檢出了245、100 kD 2條酶帶，且100 kD酶活較245 kD強。

2.2 灌漿中期酶譜

由圖1的A 2、B 2可以看出，灌漿中期均檢出300～100 kD酶活極強帶區(qū)，以及52、48、36、34、33、31 kD和27 kD等7條酶帶，且各酶帶活性B 2中均顯著高于A 2。兩泳道總酶活B 2>A 2。B 2中還檢出53、42 kD和38 kD酶帶，其酶活表現(xiàn)為38 kD>42 kD>53 kD，這3條酶帶在A 2中未檢出。從圖2可以看出，B 2較A 2多檢出1條245 kD酶帶，且酶活強。

2.3 灌漿后期酶譜

灌漿后期酶譜見圖1的A 3和B 3泳道所示，A 3、B 3中均檢出300～100 kD活性極強酶帶區(qū)，以及48、38、36、34、33、31 kD和27 kD等7條酶帶；從酶活來看，B 3中各條酶帶活性均強于A 3，兩泳道總酶活B 3>A 3；A 3中48 kD和36 kD酶帶活性強于同泳道及對應(yīng)B 3泳道的其余5條酶帶活性。B 3中檢出54 kD和42 kD 2條新酶帶，在A 3未檢出；A 3中檢出1條53 kD酶帶，B 3未檢出。

2.4 灌漿各時期酶譜

由圖1和圖2可以看出，整個灌漿期A和B葉片POD酶譜差異顯著。B中灌漿前期和后期檢出54 kD新酶帶，在B的中期及A的整個灌漿期均未檢出。B的灌漿各時期均檢出42 kD新酶帶，在A灌漿各時期均未檢到。在A 3和B 2中檢出1條53 kD酶帶，該酶帶在A和B的表達時期出現(xiàn)差異。由圖2可以看出，僅在B 1中檢出185 kD新酶帶。

酶帶活性上，各泳道總酶活由高到低依次為：B 2>B 3>A 1>A 3>B 1>A 2，可以看出A各泳道總酶活表現(xiàn)出灌漿前期強，中期弱，后期較強的特點；B各泳道的總酶活表現(xiàn)為灌漿前期弱，中、后期強的特點。38 kD酶活在B 2、B 3強，A 1稍強，其余泳道較弱；31 kD酶活在B 2強，B 3較強，其余泳道較弱；27 kD酶活在A 1、B 3中較強，其余泳道活性極弱；這3條酶帶在不同時期活性變化較大。

3 討 論

灌漿期水稻葉片生理活動旺盛，參與多種代謝活動的POD酶活和種類也發(fā)生顯著的變化[16-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，離子束誘變的水稻新品種玉稻518在灌漿期檢出3條新酶帶，包括灌漿前期檢出的185 kD酶帶，灌漿前期、后期檢出的54 kD酶帶和灌漿各時期均檢出的42 kD酶帶。因此推測，離子束可能誘導(dǎo)親本新稻03518的基因發(fā)生了突變或調(diào)控水平發(fā)生了變化。Nakai等[20]通過熱中子輻射處理水稻，獲得一個抗白葉枯病幾個菌系的突變體M41，進一步抗性鑒定獲得一個新的抗病基因xa-nm(t),證明熱中子輻照能誘導(dǎo)突變，產(chǎn)生新的抗性基因。吳躍進等[21-22]采用氮離子輻照秈稻9311，在M 2代中發(fā)現(xiàn)多個突變體，并通過基因定位確定一個新的可能控制水稻脆桿性狀的基因tsbc1，證明離子束輻照能提供新的水稻突變體，對水稻基因組研究有一定作用。董喜存等[23]對碳離子誘變的早熟高粱突變體進行同工酶分析，發(fā)現(xiàn)突變體比野生型多了一條Rf值為0.65的酯酶同工酶帶，推測是碳離子使甜高粱酯酶基因或者調(diào)控酯酶表達的基因發(fā)生了改變。這些研究與本研究中檢出新酶帶的結(jié)果相同，說明離子束可以誘導(dǎo)基因突變，引起后代的遺傳性狀改變。

從玉稻518和親本的遺傳性狀可以看出：誘變后代的葉片在灌漿期表現(xiàn)出由下而上逐漸衰老，而親本葉片的衰老過程不如誘變后代明顯；在灌漿期誘變后代抗穗頸瘟，親本中出現(xiàn)感穗頸瘟的情況，這說明誘變后代的抗瘟性較親本提高。 玉稻518中出現(xiàn)的新酶帶，可能直接影響了某些特異性狀的表現(xiàn)。

在誘變后代玉稻518中，灌漿前期檢出185 kD新酶帶，中期、后期未檢出；灌漿前期、后期檢出54 kD新酶帶，中期未檢出。新酶帶的階段性出現(xiàn)可能與水稻灌漿期的生理活動變化有關(guān)。程家勝等[24]對蘋果新梢前期生長過程中芽的POD同工酶進行分析，發(fā)現(xiàn)一個負(fù)極向擴散酶區(qū)的出現(xiàn)與消失跟芽的生長減緩或停止生長和葉片的衰老有關(guān)，認(rèn)為POD同工酶與生長節(jié)奏和衰老存在一定關(guān)系。萬文舉等[25]對多個水稻抗瘟性品種和感病性品種的POD同工酶酶譜分析，發(fā)現(xiàn)在不同時期抗瘟性品種均比感病性品種多檢出一條穩(wěn)定表達的弱活性POD酶帶，通過與感病品種的雜交驗證，認(rèn)為水稻的抗瘟性與該POD酶帶有關(guān)。劉濤等[26]對水稻灌漿不同階段蛋白質(zhì)表達差異進行雙向電泳分析，發(fā)現(xiàn)核酮糖二磷酸羧化酶大亞基的蛋白點在灌漿早期豐富，灌漿末期消失，認(rèn)為該酶的表達與灌漿周期中功能變化相關(guān)。由此推測，185 kD酶帶出現(xiàn)可能與前期某些生理功能的轉(zhuǎn)變密切相關(guān)，54 kD酶帶可能參與到水稻某個生育時期的調(diào)控進程中，42 kD酶帶可能與變異后代抗稻瘟病能力提高密切相關(guān)。這3條新酶帶(185、54 kD和42 kD)，究竟那條與水稻的抗瘟性相關(guān)？灌漿期生理功能的轉(zhuǎn)變相關(guān)？是否共同作用于一種或幾種生理過程？均有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，53 kD酶帶在親本新稻03518的灌漿后期表達，在誘變后代的灌漿中期便表達,即表達時期較親本提前；從它們的遺傳性狀上看，誘變后代玉稻518的生育期較親本新稻03518縮短3 d，說明誘變影響了后代玉稻518生育期相關(guān)基因的表達。王新望等[27]對陸地棉葉不同生育期的POD同工酶酶譜進行分析，發(fā)現(xiàn)熟期越早，該酶帶出現(xiàn)得越早，認(rèn)為部分POD同工酶帶出現(xiàn)的早晚與品種成熟期相關(guān)。楊文等[28]對30個甘蔗品種的酯酶同工酶進行電泳分析，發(fā)現(xiàn)一些遷移率低的酶帶與其開花早遲等性狀相關(guān)，認(rèn)為這些POD同工酶帶與早熟性狀相關(guān)。由此推測，本實驗檢出的53 kD酶帶可能與水稻生育期相關(guān)。

親本新稻03518僅在灌漿前、后期檢出，中期缺失，而誘變后代玉稻518在灌漿各時期均檢出245 kD和38 kD酶帶，這說明誘變對基因不同時期的表達有影響。敖良德等[29]對蘋果幼果發(fā)育過程的POD同工酶進行分析，發(fā)現(xiàn)受精后果柄中POD同工酶的酶帶數(shù)在不同時期出現(xiàn)階段性變化，認(rèn)為酶帶在某個階段的消失與出現(xiàn)和基因階段性表達相關(guān)。姬生棟等[30]對小麥生育前期綠葉中POD酶譜進行分析，發(fā)現(xiàn)不同階段和環(huán)境下，葉片中POD種類和活性有顯著變化，認(rèn)為POD同工酶的表達變化，直接反映小麥體內(nèi)某個生育期的代謝狀況。因此推測誘變后代灌漿中期某些受抑制基因被重新激活表達，對該時期的生理活動(“源”與“庫”通道建立、葉片光合效率、抗病性等)有一定影響。

誘變后代玉稻518在灌漿中、后期的總酶活較親本顯著提高，從玉稻518產(chǎn)量來看，其千粒重比親本提高2.1 g，產(chǎn)量提高451 kg/hm2，這說明灌漿中、后期POD酶活高可能直接影響到籽粒的灌漿。張小冰等通過對60Co-γ輻照甜蕎高產(chǎn)突變體的第三代種子下胚軸的POD同工酶分析，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)株的POD活性較對照組高2倍，認(rèn)為高產(chǎn)株P(guān)OD酶活與高產(chǎn)性狀呈正相關(guān)[31]；蔡永萍等對灌漿期水稻劍葉POD酶活變化的分析發(fā)現(xiàn)葉片POD酶活高能保證較高的灌漿速率，后期延緩葉片衰老，得出POD酶活高能使籽粒干物質(zhì)迅速積累的結(jié)果[32]。因此推測，誘變后代中、后期POD總酶活提高，是為了清除旺盛代謝活動產(chǎn)生的大量H2O2，維持功能葉片的活性。灌漿后期POD酶活高有利于物質(zhì)的高效合成、分解和“源”與“庫”之間物質(zhì)的運輸和積累。