響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓輔助提取紫薯花色苷的工藝研究

陳亞利,嚴(yán)成,張唯,陳燁,楊雁

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

紫薯(IpomoeabatatasPoir.)，又稱黑薯、烏心苕等，培育最早起源于日本。因其產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)，我國(guó)于20世紀(jì)90年代從日本引種栽植[1]。紫薯富含花色苷，其具有藥用價(jià)值及保健功能，如提高人體免疫力、抗腫瘤、抗衰老及預(yù)防和治療高血壓等功效[2-6]，故一直被人們所重視。同時(shí)，花色苷又是天然的水溶性色素，因其無毒無害，且相比其他色素更穩(wěn)定，故一直被作為食用類色素添加到食品中。從現(xiàn)有的報(bào)道中可知，對(duì)紫薯花色苷的研究多集中在提取及結(jié)構(gòu)鑒定方面[7-11]，常見的提取方法主要有溶劑法[12,13]、超聲波輔助提取法[14-16]、微波輔助提取法[17]、酶法等，其普遍具有耗時(shí)耗能的特點(diǎn)。超高壓技術(shù)作為食品行業(yè)中非熱加工技術(shù)，近些年，在物質(zhì)有效成分提取方面有所應(yīng)用，因其與傳統(tǒng)提取方法相比，具有能耗低、提取時(shí)間短、作用溫度低等特點(diǎn)而深受重視，但在紫薯花色苷的提取方面鮮有報(bào)道，故本文選用此法。以紫薯粉為原料提取花色苷，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，分析提取劑濃度、料液比、壓力值、保壓時(shí)間等因素對(duì)花色苷得率的影響，以期為超高壓技術(shù)在紫薯花色苷提取方面的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫薯：2017年10月由四川省劍閣縣成一食品有限公司種植基地提供。

檸檬酸等試劑：均為分析純。

BSA224S 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；D2-280/2SE 小型真空封裝機(jī) 東莞市益健包裝機(jī)械有限公司；多功能粉碎機(jī) 浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；電熱恒溫干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；HPP.L2-800/1 超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；UV-3150紫外-可見光分光光度計(jì) 日本島津公司；臺(tái)式離心機(jī) 天津廣豐科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原材料預(yù)處理

挑選新鮮、無病蟲害的紫薯清洗，去皮，切片，在50 ℃電熱恒溫干燥箱烘干，粉碎，過80目篩，置于棕色試劑瓶中，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 超高壓提取條件

超高壓設(shè)備的有效體積為1 L，最高壓力值為700 MPa，癸二酸二辛酯為傳壓介質(zhì)，升壓速率為100 MPa/15 s，油溫22 ℃，保壓過程中壓力差不超過10 MPa，解壓時(shí)間10 s。

1.2.3 花色苷最大吸收波長(zhǎng)的確定

準(zhǔn)確稱取紫薯粉1.00 g，置于聚乙烯袋中，按照料液比1∶30(g/mL)加入30 mL提取溶劑(1%檸檬酸溶液)，真空包裝，于300 MPa條件下提取5 min，得到紫薯花色苷粗提液，吸取少量上清液離心，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在300～600 nm下進(jìn)行光譜掃描，以獲得最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4 總花色苷含量的計(jì)算

采用消光系數(shù)法，按照下式計(jì)算花色苷的含量(本文又稱得率)：

總花色苷含量(mg/100 g)=(A×V×n)/(m×98.2)×100。

式中:A為吸光度;V為提取液體積;n為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量;98.2為紫薯色素的摩爾消光系數(shù)，在進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的誤差可以忽略掉。

1.2.5 超高壓輔助提取方法

準(zhǔn)確稱取處理后的紫薯粉1.00 g，置于聚乙烯袋中，在室溫下按照設(shè)定的料液比、壓力值、保壓時(shí)間等，使用不同濃度的檸檬酸水溶液作為提取劑提取花色苷，離心，取上清液稀釋一定的倍數(shù)，在526 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，重復(fù)3次求平均值，依據(jù)1.2.4中公式計(jì)算紫薯中花色苷的得率。

1.2.6 溶劑提取方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)正交結(jié)果，按料液比1∶30(g/mL)取一定量的紫薯粉，加入2.0%的檸檬酸溶液，在60 ℃下提取2 h，離心，測(cè)定吸光值，按1.2.4中公式計(jì)算紫薯中花色苷的得率。

1.2.7 單因素試驗(yàn)

分別以不同濃度檸檬酸水溶液(0.20%，0.40%，0.60%，0.80%，1.00%，1.20%，1.60%，1.80%，2.00%)、料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50)、提取壓力(100，150，200，250，300，400，500 MPa)、保壓時(shí)間(1，3，5，7，10 min)為自變量，以花色苷提取得率為考量值，通過控制變量法，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定響應(yīng)面分析法各個(gè)因素的取值范圍。

1.2.8 響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取法

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定的各個(gè)因素的零水平和波動(dòng)區(qū)，以花色苷的得率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件建立4因素3水平Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平取值見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼表Table 1 The factors and levels of response surface experiment

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.6.1和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

按照1.2.3的提取方法，在300～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描紫薯花色苷色素粗提液，測(cè)定粗提液的光譜吸收特性，結(jié)果見圖1。紫薯色素粗提液在526 nm處有最大吸收，查閱文獻(xiàn)[19]可知，在520～540 nm有1個(gè)吸收峰，為典型的花色苷色譜特性，因此選526 nm為測(cè)定紫薯花色苷含量的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 紫薯花色苷紫外-可見光掃描圖譜Fig.1 UV-visible light scanning spectrum ofpurple potato anthocyanins

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取劑濃度對(duì)紫薯花色苷得率的影響

圖2 檸檬酸水溶液濃度對(duì)花色苷得率的影響Fig.2 Effect of different concentration of citric acid solution on the yield of anthocyanins

由圖2可知，檸檬酸濃度為1.8%時(shí)提取效果最好，濃度小于1.8%時(shí)，隨著檸檬酸濃度的增大，提取效率增加；濃度大于1.8%時(shí)，提取效率呈下降趨勢(shì)，這一變化與花色苷糖基在酸性條件下的穩(wěn)定性有關(guān)。當(dāng)濃度過大時(shí)，花色苷酰基化結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞，導(dǎo)致提取率降低。此外提取劑濃度過大，增加了后續(xù)脫味處理的難度，所以選擇檸檬酸溶液濃度1.8%為花色苷的最佳提取濃度。

2.2.2 壓力值對(duì)紫薯花色苷含量的影響

圖3 壓力值對(duì)花色苷得率的影響Fig.3 Effect of different pressure values on the yield of anthocyanins

由圖3可知，花色苷的得率在壓力值為100～250 MPa間，隨著壓力的增加而增加，在250 MPa時(shí)達(dá)到峰值，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這可能是由于在加壓提取過程中，升壓增加了提取劑固體組織的滲透速率，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁被破壞的數(shù)量增加，提取劑和組織接觸的面積增大，使得有效成分的溶解更加完全[20]。下降的原因可能是壓力過大使花色苷有效成分受到破壞，故選擇250 MPa進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.3 保壓時(shí)間對(duì)紫薯花色苷含量的影響

圖4 保壓時(shí)間對(duì)花色苷得率的影響Fig.4 Effect of different dwell time on the yield of anthocyanins

由圖4可知，0～5 min花色苷的得率隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在5 min時(shí)達(dá)到最大值，之后開始下降，原因可能是在高壓狀態(tài)下，有效成分快速擴(kuò)散到溶劑中達(dá)到了一個(gè)平衡，過了這個(gè)臨界點(diǎn)有效成分受到破環(huán)，從而降低了提取效果，故選擇5 min為最佳保壓時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.4 料液比對(duì)紫薯花色苷含量的影響

圖5 料液比對(duì)花色苷得率的影響Fig.5 Effect of different solid-liquid ratios on the yield of anthocyanins

由圖5可知，隨著料液比的增加，花色苷的得率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。料液比在1∶10～1∶30(g/mL)之間，花色苷的得率都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，原因是適當(dāng)增加提取劑的用量，能夠更好地促使花色苷的溶出，從而提高得率[21]。當(dāng)料液比為1∶30(g/mL)時(shí)，花色苷的得率最大，之后隨著料液比繼續(xù)增加，提取率略有下降。因此，選取1∶30為最佳的料液比。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，建立4因素3水平Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Exprimental design and results of response surface analysis

續(xù) 表

采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到提取劑濃度、料液比、保壓時(shí)間和壓力4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=80.33+1.23A+2.81B-0.44C+0.30D-0.99AB-0.28AC-0.80AD-1.76BC-1.62BD-0.14CD-1.74A2-1.71B2-0.6C2-0.91D2。

式中：Y為花色苷得率的預(yù)測(cè)值；A，B，C，D分別代表提取劑濃度、料液比、保壓時(shí)間、壓力的編碼值，為了說明模型的可行性，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

由表3可知，模型的P<0.0001，說明回歸模型差異極顯著。模型的失擬項(xiàng)檢驗(yàn)差異不顯著(P>0.05)，信噪比(S/N=31.233)大于4，可知回歸方程有極好的擬合度和可信度，能反映出提取劑濃度、料液比、保壓時(shí)間和壓力值與花色苷得率之間的關(guān)系。

模型的決定系數(shù) R2= 0.9812(R2>0.8000)，表明該模型可以解釋98.12%響應(yīng)值的變化，即樣本數(shù)據(jù)對(duì)模型回歸方程的擬合性較高，該模型的選擇是合理的，故此模型可用作對(duì)紫薯花色苷提取結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

此模型中 A，B，C，AB，AD，BC，BD，A2，B2，C2，D2為差異極顯著項(xiàng)(P<0.01)，其他項(xiàng)差異均不顯著。B的F值最大，其次是A和C，D相對(duì)較小，表明4個(gè)因素對(duì)花色苷得率的影響大小順序?yàn)锽>A>C>D，即料液比>提取劑濃度>保壓時(shí)間>壓力。

通過交互作用分析，AB，AD，BC，BD項(xiàng)有顯著交互作用，即提取劑濃度和料液比、提取劑濃度和壓力、料液比和保壓時(shí)間、料液比和壓力存在顯著交互作用，對(duì)兩組因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，考察因素間的交互規(guī)律。

通過響應(yīng)面軟件最優(yōu)組合分析得到花色苷提取的最佳工藝條件為：提取劑濃度2.0%、料液比1∶40、保壓時(shí)間3 min、壓力值200 MPa。

2.3.2 各因素之間交互作用

圖6 提取劑濃度和料液比對(duì)花色苷得率影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of extractant concentration and solid-liquid ratio on the yield of anthocyanins

由圖6可知，提取劑濃度與料液比之間的交互作用，等高線呈橢圓形，提取劑濃度與料液比對(duì)花色苷得率影響的交互作用極顯著(P<0.0001)，提取劑濃度一定時(shí)，隨著料液比的增加，花色苷的得率呈先上升后下降的趨勢(shì)；料液比一定時(shí)，隨著提取劑濃度的增加，花色苷的得率先上升后下降。

提取劑濃度與壓力之間的交互作用見圖7。

圖7提取劑濃度與壓力對(duì)花色苷得率影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of extractant concentration and pressure on the yield of anthocyanins

等高線呈橢圓形，提取劑濃度與壓力對(duì)花色苷得率影響的交互作用極顯著(P<0.0060)，提取劑濃度一定時(shí)，隨著壓力的增加，花色苷的得率呈先上升后下降的趨勢(shì)；壓力一定時(shí)，隨著提取劑濃度的增加，花色苷的得率先上升后下降，但總的變化較小。

料液比與保壓時(shí)間之間的交互作用見圖8。

圖8 料液比與保壓時(shí)間對(duì)花色苷得率影響的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of solid-liquid ratio and dwell time on the yield of anthocyanins

等高線呈橢圓形，料液比與保壓時(shí)間對(duì)花色苷得率影響的交互作用極顯著(P<0.0001)，保壓時(shí)間一定時(shí)，隨著料液比的增加，花色苷的得率呈一直增加的趨勢(shì)；料液比一定時(shí)，隨著保壓時(shí)間的增加，花色苷的得率先上升后下降，說明料液比對(duì)花色苷得率的影響比保壓時(shí)間的影響更大。

料液比與壓力值之間的交互作用見圖9。

圖9 料液比與壓力值對(duì)花色苷得率影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface of solid-liquid ratio and pressure on the yield of anthocyanins

等高線呈橢圓形，料液比與壓力值之間的交互作用對(duì)花色苷得率影響的交互作用極顯著(P<0.0001)，壓力一定時(shí)，隨著料液比的增加，花色苷的得率呈增加的趨勢(shì)；料液比一定時(shí)，隨著壓力的增加，花色苷的得率先上升后下降，料液比對(duì)花色苷得率的影響比壓力值的影響更顯著。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面所得結(jié)果的可靠性，根據(jù) Design Expert 軟件，預(yù)測(cè)出花色苷提取的最佳工藝條件：提取劑濃度為2.0%，料液比為1∶40，保壓時(shí)間為3 min，壓力值為200 MPa，并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過3次平行試驗(yàn)后，得到花色苷的含量為82.67 mg/100 g，與理論值接近(82.85 mg/100 g)，誤差較小。故用響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到的花色苷提取條件與實(shí)際擬合較好，具有可靠性和實(shí)用價(jià)值。

2.5 超高壓輔助法提取與溶劑提取法的對(duì)比

超高壓輔助法提取與溶劑提取法的對(duì)比結(jié)果見表4。

表4 兩種方法比較Table 4 Comparison of two methods

由表4可知，超高壓輔助提取法不僅提取溫度要求低且耗時(shí)短，提取效果也高于溶劑提取法。

3 結(jié)論

超高壓輔助提取紫薯花色苷，具有作用溫度低、耗時(shí)短、得率高的特點(diǎn)，對(duì)于花色苷的提取是一種不錯(cuò)的選擇。采用響應(yīng)面法對(duì)紫薯花色苷超高壓輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)響應(yīng)面模型得出的最佳工藝條件為提取劑濃度2.0%，料液比1∶40，保壓時(shí)間3 min，壓力值200 MPa，花色苷含量82.85 mg/100 g，驗(yàn)證得到花色苷的含量為82.67 mg/100 g，與預(yù)測(cè)值十分接近；從三維圖及等高線圖可以看出，各因素間的交互作用對(duì)花色苷提取得率的影響較大。綜上，響應(yīng)面法能對(duì)花色苷提取工藝進(jìn)行較好的優(yōu)化。此外，為更好地將超高壓技術(shù)應(yīng)用到活性物質(zhì)的提取中，還應(yīng)進(jìn)行超高壓對(duì)各因素影響的研究，這也是本實(shí)驗(yàn)的不足之處，故后續(xù)還需開展此方面的研究。