紅景天苷對(duì)熱射病大鼠的心功能損害機(jī)制研究

肖 輝 李俊敏

(1 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院,十堰,442000; 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院,十堰,442000)

熱射病為中暑癥狀較為嚴(yán)重的一種，以高熱、昏迷為主要臨床表現(xiàn)，研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，其早期死亡率高達(dá)70%[1]。引起熱射病因素較多，主要為高溫、大量體力勞動(dòng)等，高溫條件下熱量易傳入人體，增加了機(jī)體代謝熱量，導(dǎo)致機(jī)體自身防御功能無(wú)法與熱應(yīng)激反應(yīng)對(duì)抗，繼而使得體溫升高，對(duì)心臟功能產(chǎn)生直接損害，誘發(fā)多器官功能衰竭，最終面臨死亡[2-3]。紅景天其主要成分為紅景天苷，發(fā)揮抗疲勞、抗缺氧、益氣活血功效，已有越來(lái)越多的研究證實(shí)，紅景天苷對(duì)降低心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮重要作用，可對(duì)心臟功能進(jìn)行有效保護(hù)[4-5]。本研究以40只大鼠為對(duì)象,分作4組,予以不同干預(yù),旨在進(jìn)一步探討紅景天苷對(duì)熱射病大鼠心功能損害的保護(hù)作用與機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)雄性SD大鼠共40只,體質(zhì)量190～210 g,平均體質(zhì)量(200±10)g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可SCXK(滬)2021-0004,單位:上海亓上生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)條件:設(shè)置40%～70%濕度，18～22 ℃溫度，黑暗、照明環(huán)境下分別放置12 h，自由飲水、進(jìn)食(倫理審批號(hào):JN.No20191030b0601231)

1.1.2 藥物 4、8、32 mg/kg紅景天苷(陜西森悅生物科技有限公司,批號(hào):b1303)。

1.1.3 試劑與儀器 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)劑盒(上海源葉科技有限公司,批號(hào):S10115-15KU)、丙二醛(Malonaldehyde,MDA)試劑盒(上海滬崢生物科技有限公司,批號(hào):HS4639)、BCA蛋白試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司,批號(hào):BI-WB005-200T)、二甲亞砜(廣州勤必發(fā)商貿(mào)有限公司,批號(hào):PV6210000)、雙氯熒光黃乙酸乙酯(北京華威銳科化工有限公司,批號(hào):C34725)、嵌段式聚醚F-127(Sigma公司,批號(hào):9003-11-6)。線粒體分離試劑盒(武漢卡諾斯科技有限公司,批號(hào):B30142)、細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒[凱基生物科技有限公司,批號(hào):ImmunoChemistry(ICT)_97]。線粒體呼吸控制率定量檢測(cè)試劑(深圳子科生物科技有限公司,批號(hào):GMS10097)。紅景天苷(中國(guó)食品藥品生物檢定研究院,批號(hào)：110818-201708)。離心機(jī)(海安亭科學(xué)儀器廠,型號(hào):L3202),PCR儀(Advanced Bionics,美國(guó),型號(hào):ABI-7500),透射電鏡(日立公司,日本,型號(hào):H-7500)，計(jì)算機(jī)控制大鼠轉(zhuǎn)輪式跑步機(jī)(上海欣軟信息科技有限公司,型號(hào):YLS-15A),流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó),型號(hào)：FACS Calibur)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 依據(jù)干預(yù)方式不同將40只大鼠分為對(duì)照組,紅景天苷干預(yù)作低劑量、中劑量、高劑量組，每組10只。

在設(shè)定好的濕度與溫度下大鼠在跑步臺(tái)上跑步，設(shè)定跑步機(jī)坡度為0度，速度為15 m/min。若中途大鼠停止跑步，則以電壓100 V的電擊，直至大鼠力氣耗盡。之后，再次給予電刺激，致使大鼠癱軟在平面上不能自主翻身。判斷大鼠熱射病主要依據(jù)為：大鼠動(dòng)脈收縮壓升高至頂點(diǎn)后呈降低趨勢(shì)，直至拐點(diǎn)，或內(nèi)核溫度升高至42.5 ℃。

1.2.2 干預(yù)方法 對(duì)照組建模后予以常規(guī)飲食飼養(yǎng);低劑量組予以4 mg/kg紅景天苷;中劑量組予以8 mg/kg紅景天苷;高劑量組予以32 mg/kg紅景天苷。3組給藥方式均為填喂法。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)取材。安樂(lè)處死大鼠,對(duì)其心臟組織進(jìn)行摘除,通過(guò)緩沖液聚丁二酸丁二醇酯(Polybutylene Succinate，PBS)將血漬清洗干凈,置入離心管(2 mL)標(biāo)記,1 500 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min。于液氮中進(jìn)行冷凍,保存于-80 ℃冰箱中。2)電鏡標(biāo)本制作與觀察。通過(guò)PBS液對(duì)大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行沖洗,以1%戊二醛、1%多聚甲醛于室溫條件下進(jìn)行1 h固定,通過(guò)鋨酸于4 ℃條件下固定1 h。以乙醇展開(kāi)常規(guī)多級(jí)脫水處理,使細(xì)胞內(nèi)嵌于LX112。切片,通過(guò)1%的乙酸雙氧鈾、檸檬酸鉛進(jìn)行染色處理,于300萬(wàn)倍電子顯微鏡下對(duì)大鼠心肌結(jié)構(gòu)、線粒體形態(tài)進(jìn)行觀察。3)檢測(cè)氧自由基、線粒體膜電位、呼吸控制率。a.線粒體。選取大鼠心臟組織(0.1 g)作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，PBS液洗滌，吸干,勻漿后研磨處理,600 r/min，離心半徑8 cm，離心10 s,離心2次,沉淀物即為線粒體,加入100 μL含1%牛血清白蛋白蔗糖溶液,獲取沉淀為線粒體，保存于4 ℃環(huán)境中。b.測(cè)量線粒體膜電位。應(yīng)用100 nmol/L的HEPES(含紅色熒光)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行0.5 h孵育，分析儀器選擇流式細(xì)胞儀。c.檢測(cè)線粒體呼吸控制率。介質(zhì)液加入至反應(yīng)槽中，密封,并記錄氧濃度,將待測(cè)線粒體加入,對(duì)Ⅲ與Ⅳ態(tài)呼吸速率檢測(cè)，計(jì)算呼吸控制率。d.檢測(cè)線粒體氧自由基。線粒體懸液避光條件下放置15 min，灌洗選擇生理鹽水，時(shí)間控制在45 min作用，之后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并對(duì)結(jié)果記錄，并對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算。e.線粒體細(xì)胞膜通透性。心肌細(xì)胞重懸后,孵育15 min,對(duì)激發(fā)光波長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié),使其為288 nm、543 nm,于40倍物理鏡下對(duì)成像情況進(jìn)行觀察。4)MDA及SOD測(cè)定。檢測(cè)操作均按照說(shuō)明書進(jìn)行。5)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體輔助激活因子-1α(Peroxisome Proliferator-activated Receptor-gamma Co-activator-1α,PGC-1α)及MnSOD mRNA測(cè)定。提取總RNA后通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測(cè)定,操作嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分類資料統(tǒng)計(jì)應(yīng)用表、PXC表χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，低數(shù)量指標(biāo)采用Fisher檢驗(yàn)，多重比較采用S-N-K檢驗(yàn)，多個(gè)因素比較采用F檢驗(yàn)，隨后以SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件展開(kāi)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體膜電位、呼吸控制率及氧自由基 紅景天苷組大鼠心肌細(xì)胞膜電位、呼吸控制率與氧自由基強(qiáng)度均較對(duì)照組高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 線粒體膜電位、呼吸控制率及氧自由基比較

2.2 細(xì)胞膜通透性 對(duì)照組細(xì)胞膜通透性低于紅景天苷組，且藥物劑量與細(xì)胞膜通透性呈正相關(guān)性，細(xì)胞膜通透性隨藥物劑量增加而升高。見(jiàn)圖1。

2.3 MDA及SOD水平比較 紅景天苷組MDA較對(duì)照組低,同時(shí)SOD較對(duì)照組高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠心肌MDA及SOD活性比較

2.4 心肌細(xì)胞線粒體的變化情況 對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞顯著腫脹,可見(jiàn)細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞器散落存在,線粒體出現(xiàn)腫脹狀態(tài),且可見(jiàn)空泡改變,內(nèi)部基質(zhì)可見(jiàn)不均勻密度,內(nèi)腔有明顯的擴(kuò)張。隨著紅景天苷劑量的增加,大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷減輕。見(jiàn)圖2。

2.5 PGC-1α及MnSOD mRNA 紅景天苷組PGC-1α及MnSOD mRNA均較對(duì)照組高,且紅景天苷劑量越高,PGC-1α及MnSOD mRNA越高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠PGC-1α、MnSOD mRNA活性比較

3 討論

越來(lái)越多的資料中闡明，熱射病大鼠線粒體功能及結(jié)構(gòu)會(huì)嚴(yán)重受損，這是其出現(xiàn)多器官衰竭重要因素[6-7]。另外，在高熱條件下也會(huì)損害線粒體膜，由于蓄積較多氧自由基會(huì)對(duì)其產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害[8]。所以，清除氧自由基是對(duì)熱射病患者治療的關(guān)鍵，旨在最大程度保護(hù)線粒體膜不受損害，進(jìn)一步改善患者心臟功能。

紅景天是一種抗疲勞、抗氧化的傳統(tǒng)中藥，目前被廣泛用于抗衰老、抗缺氧、抗高原反應(yīng)中，同時(shí)也被臨床用于高血脂及心力衰竭等多種老年疾病預(yù)防中[9-10]。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度講，有效成分紅景天苷用于心腦血管疾病中，心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)得到明顯改善，最大限度避免損傷心臟功能[11]?；诋?dāng)代藥理學(xué)分析，紅景天苷會(huì)很好地保護(hù)受損線粒體，SOD活性得到提升基礎(chǔ)上能夠清除氧自由基，進(jìn)一步減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷程度[12]。

線粒體在不受損情況下會(huì)有氧化磷酸化產(chǎn)生，但若細(xì)胞膜凋亡則會(huì)降低線粒體膜電位[13]。通常情況下，若線粒體呼吸控制率下降也表示線粒體功能降低[14]。部分學(xué)者指出，產(chǎn)生大量氧自由基標(biāo)志著脂質(zhì)抗氧化及過(guò)氧化系統(tǒng)失衡，會(huì)增加器官功能障礙程度[15-16]。MDA為受損后氧自由基產(chǎn)物，SOD為清除氧自由基主要酶，因此可通過(guò)MDA、SOD指標(biāo)變化情況判斷機(jī)體受損程度[17-18]。PGC-1α是糖代謝的主要因子，可促進(jìn)線粒體合成，對(duì)氧化蛋白進(jìn)行拮抗[19]。MnSOD mRNA會(huì)拮抗氧自由基損傷過(guò)程，為線粒體主要酶[20-21]。熱射病發(fā)生后,大鼠PGC-1α、MnSOD mRNA均下調(diào),提示熱射病大鼠存在PGC-1α、MnSOD mRNA功能受損。

本研究表明:紅景天苷劑量越大,大鼠心肌細(xì)胞膜電位、呼吸控制率與細(xì)胞膜通透性越高、大鼠心肌氧自由基越低,MDA低表達(dá),SOD與PGC-1αmRNA、MnSOD mRNA呈高表達(dá)，對(duì)熱射病大鼠來(lái)說(shuō)，紅景天苷會(huì)有效降低組織受損程度，提高呼吸控制率、線粒體膜電位,同時(shí)對(duì)MDA進(jìn)行抑制,提升SOD及PGC-1α、MnSOD mRNA表達(dá),達(dá)到保護(hù)大鼠心肌的效果。

綜上所述，紅景天苷用于熱射病大鼠干預(yù)中，有助于降低其心功能損傷程度，對(duì)心功能改善和呼吸控制率提升均具有重要意義。且劑量越高,效果越明顯,其機(jī)制可能為上調(diào)PGC-1α、MnSOD mRNA表達(dá)有關(guān)。但因本研究未開(kāi)展臨床研究，所以之后需要擴(kuò)展研究范圍，為疾病治療提供基礎(chǔ)和依據(jù)。