二氨基庚二酸激活NOD1信號(hào)通路對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響

柳磊，張武，李召彬，李濱，徐貫杰，王園園，王金星

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 心臟外科，河北 石家莊 050051；2.安岳縣人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，四川 資陽(yáng) 642350； 3.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 麻醉科，河北 石家莊 050051；4.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050051)

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

1.2 心肌缺血再灌注模型的建立

將40只C57/BL6雄性小鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、I/R組、DAP組和I/R+DAP組，每組10只。I/R小鼠模型按照徐多嬌等[9]所述的模型制作方式進(jìn)行制作，麻醉后通過(guò)左胸廓切開(kāi)術(shù)將心臟暴露并外露，將左前降支冠狀動(dòng)脈(LAD)進(jìn)行結(jié)扎，然后將心臟立即放回胸腔內(nèi)，并進(jìn)行關(guān)胸縫合。對(duì)假手術(shù)小鼠進(jìn)行相同的手術(shù)操作，但只穿線不結(jié)扎。缺血30 min后，剪開(kāi)結(jié)扎線，然后將心肌再灌注24 h。DAP組和I/R+DAP組小鼠在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前30 min腹腔注射DAP(100 μg·只-1，生理鹽水稀釋)。假手術(shù)組和I/R組小鼠注射等劑量的生理鹽水。24 h再灌注后通過(guò)腹膜內(nèi)注射三溴乙醇(1 mg·只-1)處死小鼠，獲取心臟組織。

1.3 實(shí)時(shí)定量R PCR

1.4 心肌梗死面積評(píng)價(jià)

1.5 免疫組化分析

1.6 細(xì)胞凋亡測(cè)定

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間的差異采用單因素方差分析(ANOVA)分析中的LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌缺血再灌注損傷對(duì)NOD1表達(dá)的影響

為了研究NOD1是否參與心肌缺血再灌注損傷，對(duì)小鼠進(jìn)行30 min缺血和24 h再灌注。qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與假手術(shù)組比較，I/R組NOD1 mRNA表達(dá)水平和NOD1蛋白水平顯著高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明心肌缺血再灌注損傷顯著地增加NOD1 mRNA表達(dá)和NOD1蛋白表達(dá)(圖2)。

2.2 DAP激活NOD1對(duì)心肌梗死面積的影響

在缺血前對(duì)心肌缺血再灌注小鼠注射NOD1的激動(dòng)劑配體DAP，再灌注24 h后測(cè)量梗死面積，結(jié)果顯示，I/R組梗死面積比值明顯高于假手術(shù)組，且I/R+DAP組小鼠梗死面積最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖2假手術(shù)組與I/R組NOD1mRNA和蛋白的表達(dá)

由于DAP組與假手術(shù)組的危險(xiǎn)區(qū)面積/左心室面積和梗死面積/危險(xiǎn)區(qū)面積比值小于0.01，因此未在表中顯示，檢驗(yàn)結(jié)果顯示DAP組與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異。

表1I/R組與I/R+DAP組心肌梗死情況

組 別n(危險(xiǎn)區(qū)面積/左心室面積)(梗死面積/危險(xiǎn)區(qū)面積)I/R組100.12±0.010.58±0.07I/R+DAP組100.22±0.020.6±0.05t值4.1171.832P值0.0220.198

2.3 DAP激活NOD1對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

假手術(shù)組與DAP組的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然而，在心肌缺血再灌注損傷24 h后，與假手術(shù)組相比，I/R組和I/R+DAP組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，I/R+DAP組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖34組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

2.4 DAP激活NOD1對(duì)I 6炎癥反應(yīng)的影響

2.5 DAP激活NOD1對(duì)N κB p65磷酸化的影響

3 討 論