miR-182在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

姚紅梅，孔凡榮，周燁

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)寧 272100)

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

選取2015年10月至2017年4月在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的42例子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本，患者年齡30～65歲，平均(52.04±7.24)歲；其中Ⅰ型30例，Ⅱ型12例。所有患者手術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療等，術(shù)中收集子宮內(nèi)膜癌組織；另外選取同期因子宮脫垂或子宮頸癌等原因進(jìn)行子宮切除術(shù)且病理檢查顯示子宮內(nèi)膜正常的標(biāo)本15例，患者年齡28～65歲，平均(51.39±8.37)歲，術(shù)中收集正常子宮內(nèi)膜組織。本研究經(jīng)由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)許可，且所有患者對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞和試劑

GUAGAACUCACACUGGUGAGGUAACAGGAUCCGGUG

GUUCUAGACUUGCCAACUAUGGGGCGAGGACUCAGC

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.4 rea time PCR檢測(cè)mi 182或Foxo1表達(dá)

采用TRIzol試劑提取子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RNA含量，并取1g·ml-1總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。再以cDNA作為模板，使用mi182和對(duì)照U6引物配制PCR反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 12.5 μl；2.5 μmol·L-1引物2.0 μl；cDNA 2.0 μl；ddH2O 8.5 μl；輕輕混勻后離心，放入熒光定量PCR儀(applied Biosystems 7500)中。設(shè)置反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次；72 ℃末段延伸5 min，最后運(yùn)行溶解曲線程序，72 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃。內(nèi)參U6引物：F為5CTCGCTTCGGCAGCAC3′，R為5AACGCTTCACGAATTTGCG3′；mi182引物：F為5ACACTCCAGCTGGGTTTGGCAATGGTAGAAC3′，R為5TGGTGTCGTGGAGTC3′。以相似的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)RL92細(xì)胞中Foxo1的表達(dá)，以GAPDH作為對(duì)照，其中Foxo1引物：F為5TGGACATGCTCAGCAG

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

抑制劑作用48 h后，收集細(xì)胞沉淀，加入適量細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量后，取20g總蛋白進(jìn)行SDPAGE電泳，并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h后使用PBST洗膜，然后分別使用Cyclin D1、Foxo1、activecaspase3和GAPDH一抗稀釋液(1∶1 000)進(jìn)行孵育，4 ℃過(guò)夜。PBST洗膜后再使用二抗稀釋液(1∶10 000)室溫孵育1 h，經(jīng)PBST洗膜后使用ECL顯色液顯色，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(Tanon)成像。

1.8 Annexin FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 mi 182在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)

2.2 mi 182與RL9 2細(xì)胞增殖

2.3 mi 182與RL9 2細(xì)胞凋亡

與Control組比較，aP<0.05

A. 為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比情況；B. Western blot檢測(cè)active caspase3的表達(dá)。與Control比較，aP<0.05

2.4 下調(diào)mi 182可促使Foxo1的表達(dá)增加

2.5 抑制Foxo1可促使RL9 2細(xì)胞的增殖并抑制凋亡

圖5抑制Foxo1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討 論