RHO1基因的HIGS表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性分析

唐 喆，張 強，項 萍

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

真核生物中大量存在一些G蛋白，這些G蛋白在細胞分化和發(fā)育中起著重要的作用，其中Rho家族蛋白是G蛋白的重要組成部分[1-3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族蛋白在基因轉(zhuǎn)錄、囊泡運輸、細胞運動和細胞增殖等方面具有調(diào)節(jié)作用，并且直接參與肌動蛋白在骨架形成時期的信號傳導(dǎo)[4-5]。近年來，對真菌Rho家族蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究也越來越多。研究報道，在釀酒酵母、芽殖酵母等真菌中RHO1基因及其同源基因與細胞極性生長、肌動蛋白重排和細胞壁形成以及細胞完整性直接相關(guān)[6-9]。在真菌粗糙脈孢霉和黑曲霉的rho1突變體研究中發(fā)現(xiàn)，RHO1基因?qū)τ谶@些絲狀真菌細胞壁及細胞極性形成與維持具有重要作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，RHO1基因在稻瘟菌分生孢子萌發(fā)階段表達量最高，對于稻瘟菌侵染水稻具有重要的作用[12]。

尚仁福等[13]研究發(fā)現(xiàn)，小分子RNA引起的RNA干擾會導(dǎo)致基因沉默，RNA干擾技術(shù)在促進植物與病原之間互作和提高植物抗病性方面有重要作用。近年來，利用RNA干擾技術(shù)發(fā)展起來的寄主誘導(dǎo)的基因沉默(HIGS)在植物中的研究迅猛發(fā)展[14-15]。HIGS是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默技術(shù)[16]。當植物病原菌侵染含有HIGS載體的寄主時，轉(zhuǎn)基因植株可產(chǎn)生特定序列的dsRNA，進而產(chǎn)生相應(yīng)的小分子RNA，從而引起該病原菌關(guān)鍵基因表達量下降。病原菌內(nèi)源的特定基因表達受到影響，從而使寄主獲得對該病原菌的抗性。由此可見，該技術(shù)不僅可以從反向遺傳學(xué)方向鑒定病原菌的遺傳學(xué)特性，也能夠通過沉默病原菌關(guān)鍵基因，提高植物抗病性。

稻瘟菌(Magnaportheoryzae)是引起水稻病害的一種病原真菌，它也是用于絲狀真菌研究的重要模式生物之一。由稻瘟菌引起的稻瘟病是水稻的重要病害之一，能夠引起水稻減產(chǎn)甚至絕收，嚴重影響了世界糧食安全。稻瘟病菌基因組序列已經(jīng)被成功測序，分析結(jié)果表明，稻瘟菌可能存在11 109個基因[17]。將這些基因大致分為兩類：一類是生長所需基因，它與菌體生長發(fā)育息息相關(guān)；一類是致病相關(guān)基因，在侵染寄主時具有重要作用。RHO1基因是生長所需基因，與其相互作用的蛋白涉及到病原菌生長發(fā)育繁殖等生物進程[18]。隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，研究者已經(jīng)將不同類型的外源基因轉(zhuǎn)入到水稻中，如過量表達白藜蘆醇合成酶基因(Resveratrol synthase,RS)，能夠提高轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病的耐性[19]；過量表達病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-Related proteins,PRs)——β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-gulcanase)，用于研究抗稻瘟菌水稻[20]。然而利用HIGS技術(shù)研究稻瘟菌和水稻之間相互作用的報道尚未見。為此，本研究選取了對稻瘟菌分生孢子萌發(fā)具有重要作用的RHO1基因，通過構(gòu)建RHO1基因的HIGS載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化進入日本晴水稻中，研究轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟菌的抗性，為稻瘟病的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與試劑

稻瘟菌70-15、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌AGL1、質(zhì)粒 pDONR 221(Kan+)、水稻日本晴種子，均為西農(nóng)林科技大學(xué)許金榮實驗室保存；質(zhì)粒pBDL03，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈；大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細胞由許金榮實驗室制備；TRIzol?Reagent、Gateway?BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、Gateway?LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix，均購于Invitrogen公司；快速內(nèi)切酶(KpnⅠ、SacⅠ、EcoR Ⅴ)，dNTP，TaqDNA聚合酶，均購于Fermentas公司；抗生素(卡那霉素(Kan)、潮霉素(Hyg)、利福平(Rif))購于Roche公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，均購于百泰克公司；其他試劑為國產(chǎn)化學(xué)純，引物合成和測序由北京奧科公司完成。

1.2 RNA干擾序列的選擇與引物設(shè)計

通過查詢稻瘟菌基因組數(shù)據(jù)庫(http://fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/Info/Index)，獲得RHO1基因(MGG_07176)的編碼序列(CDS)區(qū)域。利用BLOCK-iTTMRNAi Designer在線工具(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)查找適合用于沉默的片段。利用 Primer 5.0設(shè)計干擾區(qū)特異性引物RHO1-F和RHO1-R。該片段不含EcoRⅤ、SacⅠ、KpnⅠ的酶切位點。引物序列如下：RHO1-F.5′-GGGGA-CAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCGTC-GCTGATGTGGAGGT-3′，RHO1-R.5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCT-GGGTC CGAACA-CCTCACGGACACC-3′，其中引物序列中添加了Gateway的接頭序列(下劃線所示)。

1.3 RNA提取與目標干擾片段的獲得

利用TRIzol(按照試劑操作說明)提取稻瘟菌70-15的總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。然后以該cDNA為模板，利用PCR技術(shù)進行特異性干擾片段的擴增。PCR擴增體系(50 μL)： cDNA 1 μL，10 μmol/L的特異性引物RHO1-F和RHO1-R各2 μL，10×PCR buffer(含MgCl2) 5 μL，dNTPs 2 μL，TaqDNA聚合酶0.6 μL，ddH2O 36.4 μL。PCR擴增程序： 94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min, 16 ℃保存。PCR產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，驗證其條帶長度正確后，使用凝膠回收試劑盒回收目標條帶，并測定其濃度。

1.4 HIGS表達載體的構(gòu)建

1.4.1 入門載體構(gòu)建 利用Gateway試劑盒進行BP反應(yīng)，構(gòu)建入門載體 pDONR 221-RHO1(圖1)。

圖1 基于pDONR 221載體與稻瘟菌RHO1基因片段構(gòu)建入門載體pDONR 221-RHO1示意圖Fig.1 Construction of pDONR 221-RHO1 by recombination of pDONR 221 plasmid and rice blast RHO1 gene fragment

用凝膠電泳回收純化后具有接頭序列的PCR產(chǎn)物與載體 pDONR 221進行基因重組反應(yīng)。按照試劑使用說明，采用下列體系：PCR 產(chǎn)物 2 μL(100 ng)，質(zhì)粒 pDONR 221 1 μL(150 ng)，BP克隆混合酶溶液1 μL，TE緩沖液(pH 8.0)補至5 μL。輕輕混合均勻，25 ℃孵育過夜；加入1 μL蛋白酶K溶液(100 μmol/L)混勻，37 ℃孵育10 min；終止BP反應(yīng)。將BP反應(yīng)后得到的產(chǎn)物稀釋5倍，取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后涂布在含50 mg/L卡那霉素的LB篩選平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取篩選平板上單克隆的大腸桿菌DH5α菌落，在10 mL含有50 mg/L卡那霉素的LB溶液中培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒pDONR 221-RHO1，利用RHO1-F和RHO1-R 進行PCR檢測，以獲得陽性克隆。將陽性克隆送奧科公司基因測序，測序正確即成功構(gòu)建入門載體。

1.4.2 表達載體構(gòu)建 將測序正確的入門載體pDONR 221-RHO1，利用EcoRⅤ內(nèi)切酶進行線性化，反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒pDONR 221-RHO1 2 μg，EcoRⅤ 1 μL，buffer 2 μL，ddH2O補至20 μL，37 ℃孵育20 min， 80 ℃處理5 min，酶切產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用凝膠回收試劑盒回收目標條帶，并測定其濃度。

線性化的入門載體 pDONR 221-RHO1在RNAi干擾片段兩端具有attL1和attL2 2個重組位點，表達載體pBDL03含有attR1和attR2 2個重組位點，二者在Gateway LR反應(yīng)中能夠發(fā)生同源重組，表達載體上的attR1和attR2之間的序列ccdB被線性化入門載體上RHO1的RNAi干擾片段替換，從而構(gòu)建成完整的HIGS表達載體pBDL03-RHO1(圖2)。

Gateway LR反應(yīng)構(gòu)建HIGS表達載體，按照試劑盒使用說明，采取下列反應(yīng)體系：線性化入門載體pDONR 221-RHO1 100 ng，pBDL03 空載體 100 ng，Gateway LR反應(yīng)酶混合物(LR enzyme mix) 1 μL，TE緩沖液(pH 8.0)補至5 μL，輕輕混勻，25 ℃孵育過夜。加入1 μL 蛋白酶K溶液(100 μmol/L)混勻，37 ℃孵育10 min，終止Gateway LR反應(yīng)。將Gateway LR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋5倍，取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后涂布在含50 mg/L卡那霉素的LB篩選平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取篩選平板上單克隆的大腸桿菌 DH5α菌落，在10 mL含有50 mg/L卡那霉素的LB溶液中過夜培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒pBDL03-RHO1，利用SacⅠ和KpnⅠ雙酶切進行鑒定。利用pBDL03空載體作為對照，鑒定陽性克隆。利用在GUS linker處設(shè)計的測序引物(GUSLR1：5′-GACCA AAGCC AGTA AAGTA GAACG-3′，GUSLF2：5′-CGTCG GTGAA CAGGT ATGGA-A-3′)測定靶標序列。測序正確表明成功構(gòu)建了HIGS表達載體pBDL03-RHO1。

圖2 HIGS表達載體pBDL03-RHO1構(gòu)建示意圖Fig.2 Construction of HIGS expression vector pBDL03-RHO1

1.5 轉(zhuǎn)基因植物的獲得與鑒定

利用農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的HIGS載體pBDL03-RHO1 轉(zhuǎn)化進入農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后涂布在含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的LB篩選平板上，28 ℃培養(yǎng)36～48 h，從篩選平板上選取單克隆農(nóng)桿菌，液體搖培，然后提取質(zhì)粒，利用SacⅠ和KpnⅠ雙酶切進行鑒定，鑒定正確的農(nóng)桿菌可用于水稻轉(zhuǎn)化。

參照Hiei等[21]的方法進行水稻日本晴的轉(zhuǎn)化。將水稻日本晴的成熟愈傷組織和攜有HIGS載體pBDL03-RHO1的農(nóng)桿菌AGL1進行共培養(yǎng)，經(jīng)過含有潮霉素的培養(yǎng)基進行2～3次篩選，得到含有抗性的愈傷組織，經(jīng)過分化再生，得到正確的水稻日本晴的轉(zhuǎn)基因株系。

利用HIGS載體pBDL03-RHO1上帶有的紅色熒光蛋白標記基因mCherry，觀察紅色熒光[22-23]；利用潮霉素基因以及RHO1基因的RNA干擾片段，進行PCR擴增檢測，以獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析

對于鑒定正確的轉(zhuǎn)基因植株，從中隨機選取5株進行稻瘟菌孢子接種試驗[24]。收集成熟的稻瘟菌分生孢子，用0.25%明膠溶液將稻瘟菌分生孢子配制成1×105mL-1孢子懸浮液，用噴霧器將該孢子懸浮液均勻地噴到3葉期的水稻日本晴(包括野生型和轉(zhuǎn)基因植株)葉片上，25 ℃黑暗條件下保濕2 d，然后進行正常培養(yǎng)，接種7 d后對水稻葉片上病斑進行觀察，選取接種水稻葉片中部(長度約為5 cm)進行病斑計數(shù)。以野生型水稻葉片上病斑數(shù)量為1，計算轉(zhuǎn)基因水稻相對病斑數(shù)，進而分析其抗病性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RHO1基因片段的獲得

通過查詢稻瘟菌基因組數(shù)據(jù)庫得到RHO1的CDS序列，利用BLOCK-iTTMRNAi Designer工具分析設(shè)計最佳的RNA干擾片段，以該片段序列設(shè)計獲得特異性引物RHO1-F和RHO1-R。提取稻瘟菌70-15的總RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用引物RHO1-F和RHO1-R擴增獲得特異性片段，其長度為389 bp (圖3)。

2.2 BP反應(yīng)構(gòu)建入門載體 pDONR 221-RHO1及其鑒定

將RHO1基因片段PCR產(chǎn)物連接到入門載體pDONR 221后，隨機選擇幾個單克隆的菌落，搖培后提取質(zhì)粒。以質(zhì)粒為模板，RHO1-F和RHO1-R為引物進行PCR檢測，結(jié)果顯示片段長度為400 bp左右，將其送奧科公司對pDONR 221-RHO1測序，測序比對結(jié)果(圖4)表明，RHO1基因片段已成功轉(zhuǎn)入入門載體pDONR 221。

M.DNA Marker DS 2000；1.擴增的RHO1基因M.DNA Marker DS 2000；1.Amplification of RHO1 gene 圖3 稻瘟菌基因RHO1片段檢測結(jié)果Fig.3 Detection of rice blast gene RHO1 fragment

*所示為構(gòu)建pDONR 221-RHO1測序結(jié)果中與RHO1基因片段完全比對上的堿基序列* means the same sequence of vector pDONR 221-RHO1 alignment with RHO1 gene圖4 構(gòu)建的質(zhì)粒pDONR 221-RHO1與RHO1基因序列的比對Fig.4 Sequencing of vector pDONR 221-RHO1 alignment with RHO1 gene

2.3 LR反應(yīng)構(gòu)建HIGS表達載體pBDL03-RHO1及其鑒定

圖5顯示，構(gòu)建正確的重組HIGS表達載體pBDL03-RHO1經(jīng)SacⅠ和KpnⅠ雙酶切后，通過電泳分離可分別獲得長度約為10和2 kb的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 轉(zhuǎn)基因植物的獲得與鑒定

將成功構(gòu)建的HIGS表達載體pBDL03-RHO1電轉(zhuǎn)化進入農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細胞，經(jīng)過篩選獲得含有HIGS載體的農(nóng)桿菌菌株。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將HIGS表達載體轉(zhuǎn)化進入水稻中，獲得含有HIGS表達載體的轉(zhuǎn)基因水稻植株。經(jīng)過培養(yǎng)后收獲種子，通過繁殖獲得F1代植株，通過mCherry紅色熒光觀察初步鑒定其為陽性轉(zhuǎn)基因植株。

M.DNA Marker DS 2000;1～2.陽性克隆質(zhì)粒酶切結(jié)果M.DNA Marker DS 2000;1-2.Digested plasmid of positive clone圖5 表達載體pBDL03-RHO1的SacⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定結(jié)果Fig.5 Verification of expression vector pBDL03-RHO1 by SacⅠ and KpnⅠ double restriction enzyme digestion

提取F1代轉(zhuǎn)基因水稻的總DNA，使用潮霉素基因片段的特異性引物和轉(zhuǎn)入的RHO1基因片段的特異性引物進行鑒定。PCR擴增結(jié)果(圖6和圖7)顯示，野生型水稻日本晴中不存在潮霉素基因片段和RHO1基因片段，而在陽性的轉(zhuǎn)基因水稻中擴增到了特異的潮霉素基因片段(750 bp)和RHO1基因片段(389 bp)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明含有RHO1基因的HIGS表達載體的轉(zhuǎn)基因水稻植株構(gòu)建成功。

2.5 HIGS轉(zhuǎn)基因植株的抗病性

將鑒定的F1代陽性轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)至3葉期時，接種稻瘟菌70-15,分析轉(zhuǎn)基因植株抗病性。圖8顯示，與野生型水稻日本晴相比，HIGS轉(zhuǎn)基因植株對稻瘟菌的抗性提高，但不同轉(zhuǎn)基因株系之間抗病性略有差異。統(tǒng)計分析表明，與野生型相比，HIGS轉(zhuǎn)基因植株葉片上的病斑數(shù)時顯減少(圖9)。這表明HIGS轉(zhuǎn)基因植株對稻瘟菌具有抗性，但不同株系之間抗病性存在一定的差異。

M.DNA Marker DS 2000；1～5.轉(zhuǎn)化pBDL03-RHO1的陽性植株;WT.野生型水稻日本晴M.DNA Marker DS 2000;1-5.Transgenic plants carrying pBDL03-RHO1;WT.Wild type rice圖6 轉(zhuǎn)基因水稻潮霉素片段PCR檢測結(jié)果Fig.6 PCR detection of HYG fragment in transgenic rice plants

WT.野生型水稻日本晴；1～5.轉(zhuǎn)基因水稻 WT.Wild type rice;1-5.Transgenic rice圖8 稻瘟菌70-15在野生型和HIGS轉(zhuǎn)基因水稻上的發(fā)病情況Fig.8 Disease symptom developed on the wild type and transgenic rice inoculated by Magnaporthe oryzae strain 70-15

3 討 論

傳統(tǒng)構(gòu)建表達載體的方法是通過酶切連接的方法將目的基因連接入表達載體，酶切位點的選擇、合適的表達載體選擇以及連接進入載體正確方向的保證都是傳統(tǒng)表達載體構(gòu)建的難點和重點。有時由于缺乏合適的酶切位點，則需采用平端位點連接，更是增加了篩選陽性克隆的工作量。本研究利用Gateway技術(shù)的特異位點重組技術(shù)，構(gòu)建了稻瘟菌RHO1基因的HIGS表達載體，這種技術(shù)具有簡單方便、轉(zhuǎn)化效率高的特點。該方法只需要兩步就可以將外源基因?qū)氲紿IGS表達載體。第一步，經(jīng)過Gateway的BP反應(yīng)，將外源基因RHO1連接到入門載體pDONR 221上；第二步，利用Gateway的LR反應(yīng)，將pDONR 221上的RHO1片段整合到pBDL03中，得到HIGS表達載體pBDL03-RHO1。最終構(gòu)建的載體由UBi啟動子驅(qū)動，GUS linker 連接的兩個反向序列產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)，形成dsRNA，可以進行下一步干擾試驗。

水稻轉(zhuǎn)基因試驗具有周期長、工作量大等特點，快速準確鑒定陽性植株，區(qū)分假陽性和陰性對照，是保證試驗順利進行的關(guān)鍵技術(shù)。本研究將構(gòu)建好的pBDL03-RHO1表達載體，利用農(nóng)桿菌AGL1，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化進入水稻日本晴中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。選取的pBDL03-RHO1表達載體有眾多的篩選標記，陽性轉(zhuǎn)基因植株可通過觀察mCherry紅色熒光蛋白、檢測潮霉素基因和檢測轉(zhuǎn)入的RNAi基因RHO1片段來鑒定。試驗結(jié)果表明，3種檢測手段結(jié)果一致，均可用于轉(zhuǎn)基因植株的檢測。初步檢測利用觀察mCherry紅色熒光蛋白，簡單、方便、成本較低，為大量篩選陽性的轉(zhuǎn)基因植株節(jié)省了時間、人力、物力和財力，可以大大提高陽性轉(zhuǎn)基因植株的篩選效率。進一步檢測轉(zhuǎn)入的載體上的抗性基因和轉(zhuǎn)入的外源干擾基因片段，保證了初篩的陽性轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)果更加準確和可靠。

RNA干擾技術(shù)具有特異高效、操作簡單方便等特點，近年來被廣泛應(yīng)用到基因功能的研究中。隨著RNA干擾技術(shù)的發(fā)展，寄主誘導(dǎo)的基因沉默(HIGS)在植物中的應(yīng)用研究快速發(fā)展。本研究成功獲得了含有RHO1基因的水稻HIGS轉(zhuǎn)基因植株，該轉(zhuǎn)基因植株含有稻瘟菌70-15的RHO1基因為靶標的dsRNA，當?shù)疚辆秩驹撍緯r，該dsRNA具有引發(fā)RNAi干擾的潛力，沉默RHO1基因，影響RHO1的表達，從而影響稻瘟菌對植物的侵染。接種試驗結(jié)果表明，與野生型水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻病斑數(shù)減少，表明稻瘟菌對該轉(zhuǎn)基因水稻的侵染力有一定程度的降低。然而，相比于HIGS在作物抗布氏白粉菌[25]和輪枝鐮孢菌[26]侵染中的應(yīng)用，本試驗中轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性還有待進一步優(yōu)化提高。

近年來，HIGS技術(shù)迅猛發(fā)展，已經(jīng)成為控制真菌病害的重要手段之一[25-26]，其在抗病轉(zhuǎn)基因作物的培育方面具有廣闊的應(yīng)用前景。該技術(shù)通過將病原菌關(guān)鍵基因的同源序列轉(zhuǎn)入植株，并在植物體內(nèi)形成dsRNA，以達到干擾病原菌關(guān)鍵基因表達的目的，從而降低病原菌定殖水平，提高植物抗病性。與此同時，該方法針對特定的病原菌具有更高的特異性，為培育遺傳穩(wěn)定、特異性強和環(huán)境安全的轉(zhuǎn)基因作物奠定了基礎(chǔ)。然而，并不是所有的HIGS轉(zhuǎn)基因作物均可沉默病原菌基因并達到預(yù)期效果[27]。如何有效確定關(guān)鍵的用于沉默的基因片段，怎樣構(gòu)建方便使用的基因表達載體等問題，對于不同真菌和植物互作研究以及轉(zhuǎn)基因植物的抗病性獲得非常必要，因此該技術(shù)還有待進一步發(fā)展和完善。