產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株的構(gòu)建

劉 港，李 潔，任津瑩，郭慶煥，趙 東，陳葉福*，郭學(xué)武，肖冬光

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.中國(guó)輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

白酒的主要成分是酒精和水，約1%～2%為對(duì)白酒風(fēng)味起主導(dǎo)作用的微量成分，其中酯類物質(zhì)又占這些微量成分的60%～90%[1]。適宜的乳酸乙酯含量對(duì)中國(guó)白酒的風(fēng)味和質(zhì)量至關(guān)重要。清香型白酒酯類化合物中乳酸乙酯僅次于乙酸乙酯，而對(duì)于老白干香型白酒和米香型白酒來說，乳酸乙酯含量高于乙酸乙酯，其在老白干香型的比例為1.5～2.2∶1，米香型白酒的乳酸乙酯含量≥0.3g/L[2-4]。傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程中，通常以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為發(fā)酵主體，結(jié)合環(huán)境和自然制曲提供的產(chǎn)酯前體乳酸菌等微生物產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，并與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)來提高白酒品質(zhì)[5]。隨著白酒工業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展，釀造技術(shù)的機(jī)械化越來越受到人們的關(guān)注，清潔生產(chǎn)和良好生產(chǎn)規(guī)范（good manufacturing practices，GMP）理念逐步在白酒行業(yè)應(yīng)用，白酒行業(yè)將迎來重大的變革[6]。白酒生產(chǎn)機(jī)械化對(duì)一些傳統(tǒng)工藝提出了新的挑戰(zhàn)，同時(shí)意味著發(fā)酵過程中乳酸菌等微生物的帶入幾率下降，乳酸乙酯的生成量下降，嚴(yán)重影響白酒風(fēng)味。因此，白酒機(jī)械化必須與發(fā)酵微生物的研發(fā)同步[7]。構(gòu)建具有一定產(chǎn)乳酸進(jìn)而生成乳酸乙酯能力的釀酒酵母菌株，不僅可以使發(fā)酵易于控制，而且可以增加乳酸乙酯的產(chǎn)量，彌補(bǔ)白酒的風(fēng)味的不足，在特征飲料酒的釀造中大有用武之地。酵母改造產(chǎn)乳酸多應(yīng)用于工業(yè)上聚乳酸生產(chǎn)，2003年COLOMBIé S等[8]將植物乳酸桿菌（Lactobacillus planetarium）的乳酸脫氫酶基因ldhL1整合到釀酒酵母基因組中，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后重組菌株的L-乳酸產(chǎn)量達(dá)50g/L，為聚乳酸的生產(chǎn)提供大量的L-乳酸前體。2009年TOKUHIRO K等[9]在釀酒酵母中增加乳酸脫氫酶基因LDH的拷貝數(shù)至四拷貝，突變株的L-乳酸產(chǎn)量達(dá)74.1g/L，乳酸對(duì)葡萄糖的產(chǎn)率明顯提高，達(dá)0.69g/g。國(guó)內(nèi)尚未見釀酒酵母過表達(dá)乳酸脫氫酶生產(chǎn)L-乳酸進(jìn)而產(chǎn)乳酸乙酯應(yīng)用于白酒工業(yè)的研究報(bào)道。

本研究利用同源重組[10-11]技術(shù)，用植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因ldhL1替換釀酒酵母丙酮酸脫羧酶基因PDC1獲得產(chǎn)L-乳酸進(jìn)而生成乳酸乙酯的能力的重組菌株。并分別模擬液態(tài)白酒發(fā)酵和外源添加乳酸進(jìn)行發(fā)酵，研究產(chǎn)乳酸菌株與出發(fā)株外源添加乳酸發(fā)酵產(chǎn)乳酸乙酯的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒見表1。其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）用以乳酸脫氫酶基因ldhL1的擴(kuò)增模板，pUG6質(zhì)粒為篩選標(biāo)記loxp-KanMX-loxp的擴(kuò)增模板，pGAPza質(zhì)粒用以篩選標(biāo)記KanMX的丟除。

表1 菌株和質(zhì)?；蛐鸵约皝碓碩able 1 Genotype and sources of strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L。

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫80 1.0mL/L，乙酸鈉5.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，硫酸鎂0.58g/L，硫酸錳0.25 g/L，調(diào)節(jié)pH至6.2～6.6。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L。

上述培養(yǎng)基配制固體培養(yǎng)基時(shí)加2%瓊脂，121℃滅菌15 min。

半乳糖誘導(dǎo)液態(tài)培養(yǎng)基：半乳糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，121℃滅菌15 min。

一級(jí)種子培養(yǎng)基和二級(jí)種子培養(yǎng)基分別由糖度為8°Bx和12°Bx的玉米水解液加5 mg/L的酵母浸粉構(gòu)成；發(fā)酵培養(yǎng)基為糖度為18°Bx的玉米水解液加適量營(yíng)養(yǎng)鹽組成。種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基105℃滅菌15 min備用。

1.1.3 試劑

PrimeSTAR Max高保真脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（2×）、rTaq聚合酶（5 U/μL）、DNA連接酶SolutionI（350 U/μL）、限制性內(nèi)切酶XbaI（5 U/μL）和BamHI（5 U/μL）：大連寶生物工程有限公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）：美國(guó)Amreco公司；遺傳霉素（G418）：美國(guó)Merck公司；耐高溫糖化酶（2×104U/mL）、液化酶（1×105U/mL）、酸性蛋白酶（1×105U/mL）：丹麥Novozymes公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、切膠回收試劑盒：北京Solarbio科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCT-200聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴(kuò)增儀、DYY-4c型電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司；AgilentGC7890氣相色譜儀（gas chromatography，GC）、Agilent 1100型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)乳酸乙酯菌株的構(gòu)建

純種釀酒酵母自身沒有乳酸代謝的能力，不能進(jìn)一步產(chǎn)乳酸乙酯。因此，本研究利用釀酒酵母PGK終止子和篩選標(biāo)記KanMX，并用植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因ldhL1替換酵母的丙酮酸脫氫酶基因PDC1，以獲得一株產(chǎn)乳酸進(jìn)而具有產(chǎn)乳酸乙酯能力的菌株。

（1）引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank報(bào)導(dǎo)的PDC1、ldhL1基因的核苷酸序列，本實(shí)驗(yàn)所用到的PCR反應(yīng)引物見表2。用Primer 5.0對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，所有引物均由蘇州金唯智有限公司合成，酶切位點(diǎn)加下劃線表示。

表2 PCR引物及序列Table 2 PCR primers and their sequences

注：“U”表示上游引物，“D”表示下游引物。

（2）DNA提取及純化

基因組DNA提取及DNA純化回收參見文獻(xiàn)[12]；質(zhì)粒提取方法參見文獻(xiàn)[13]。

（3）重組質(zhì)粒Yep352-PK的構(gòu)建

以出發(fā)菌株AY12-α的基因組和質(zhì)粒pUG6作為模板，分別擴(kuò)增得到終止子PGK1T和篩選標(biāo)記KanMX片段，將純化的PGK1T和KanMX片段融合，得到融合片段PGK1T-KanMX。將純化的PGK1T-KanMX片段和Yep352質(zhì)粒分別用XbaI和BamHI酶切，回收后進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒Yep352-PK。構(gòu)建的質(zhì)粒Yep352-PK用以帶乳酸脫氫酶基因IdhL1和下同源臂側(cè)翼序列的PGK1T-KanMX片段的大量擴(kuò)增，構(gòu)建過程見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒Yep352-PK的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid Yep352-PK

（4）醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化[14]與重組菌株的鑒定

以釀酒酵母AY12-α的基因組作為模板，PCR擴(kuò)增得到啟動(dòng)子兼上同源臂的PA及下同源臂PB片段；以植物乳桿菌的基因組作為模板，PCR擴(kuò)增得到乳酸脫氫酶基因ldhL1片段；以質(zhì)粒Yep352-PK作為模板，PCR擴(kuò)增得到PGK1TKanMX片段。將純化的片段：PA、ldhL1、PGK1T-KanMX和PB利用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入酵母細(xì)胞AY12-α中。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于終濃度為300 μg/mL G418的YEPD培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑取轉(zhuǎn)化子，提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

（5）轉(zhuǎn)化子篩選標(biāo)記的去除

用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法將PGAPza質(zhì)粒導(dǎo)入突變株中，通過Cre-Lxop系統(tǒng)將整合到基因組上的抗性基因KanMX去除。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線繪制

分別從斜面上挑取1環(huán)菌株AY12-α和P接種于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。每隔1 h取相應(yīng)量的活化菌體接入對(duì)應(yīng)體積的新鮮YEPD液體培養(yǎng)基中，以不加菌液的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，在生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中測(cè)定其波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制菌株AY12-α和P生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 乳酸耐受性實(shí)驗(yàn)

從斜面刮取一環(huán)AY12-α菌株接種于5 mL的YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180r/min過夜培養(yǎng)，高速離心收集菌體，并用無菌水洗兩次。測(cè)定菌液的濃度并調(diào)節(jié)菌液的OD600nm值為1.0，同時(shí)對(duì)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，依次取2 μL分別點(diǎn)滴于添加有1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、6.0%乳酸的YEPD平板上，30℃靜置培養(yǎng)2～3d，觀察菌落形態(tài)。

1.3.4 發(fā)酵性能測(cè)定

（1）玉米液態(tài)白酒發(fā)酵：分別從4℃保藏的固體斜面挑取1環(huán)出發(fā)菌株AY12-α和重組菌株P(guān)接入裝有5 mL一級(jí)種子玉米水解液培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)至穩(wěn)定期（約24 h）。將一級(jí)培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入裝有45 mL二級(jí)種子玉米水解液培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)16 h，測(cè)定菌液的OD600nm值，取相應(yīng)的體積換算成相同的菌體數(shù)量接種到配制好的135 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中。30℃培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵，每隔12 h稱質(zhì)量一次，發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定CO2總質(zhì)量損失、乙醇、乳酸、還原糖及酯類含量。

（2）外源添加乳酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：一、二級(jí)種子的培養(yǎng)與（1）中一致，依據(jù)出發(fā)菌株AY12-α對(duì)乳酸的耐受性，確定乳酸的添加濃度，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加相應(yīng)濃度的乳酸進(jìn)行發(fā)酵。30℃培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵，每隔12 h稱質(zhì)量一次，發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定CO2總質(zhì)量損失、酒精度、還原糖及酯類含量。

1.3.5 測(cè)定方法

（1）CO2總質(zhì)量損失、還原糖含量、酒精度測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。

（2）乳酸含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定發(fā)酵液中乳酸的含量。HPLC的檢測(cè)條件：HPX-87H色譜柱（300mm×7.8mm），流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸，流動(dòng)相流速為0.6 mL/min，柱溫65℃，檢測(cè)器溫度45℃，采用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。用流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后，用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾，采用外標(biāo)法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行定量。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)0.999以上方可用于數(shù)據(jù)的分析。

（3）酯類含量的測(cè)定

氣相色譜法：根據(jù)利用氣相色譜檢測(cè)白酒的文獻(xiàn)[16]，氣相色譜儀條件：AT.LZP-930白酒專用色譜柱（50 m×320 μm×1 μm）；火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），檢測(cè)器溫度200 ℃；載氣為高純氮（N2），流速5 mL/min；檢測(cè)條件：程序升溫，50℃保持8 min，5℃/min升至120℃，保持8 min；進(jìn)樣口溫度200℃；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比為10∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)乳酸菌株的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 重組質(zhì)粒Yep352-PK的構(gòu)建

使用1.3.1的方法，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒Yep352-PK。對(duì)構(gòu)建的Yep352-PK質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 重組質(zhì)粒Yep352-PK的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification of recombiant plasmid Yep352-PK

由圖2可知，以Yep352-PK為模板，擴(kuò)增得到1 871 bp的PGK1T-KanMX片段、258 bp的PGK1T片段和1 613 bp的KanMX片段。PCR驗(yàn)證結(jié)果與理論預(yù)期相符，說明PGK1TKanMX基因片段成功插入Yep352的多克隆位點(diǎn)處，Yep352-PK質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.1.2 過表達(dá)ldhL1重組菌株的構(gòu)建

將轉(zhuǎn)化片段PA、ldhL1、PGK1T-KanMX和PB用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入酵母細(xì)胞AY12-α中。通過PA和PB片段與酵母基因組上PDC1基因兩側(cè)的同源序列發(fā)生同源重組，從而實(shí)現(xiàn)了ldhL1基因的過表達(dá)盒整合到釀酒酵母染色體上，同源重組過程如圖3所示。

圖3 轉(zhuǎn)化片段的重組過程Fig.3 Homologous recombination process of converted fragments

在上同源臂PA上游設(shè)計(jì)引物P1-U，結(jié)合ldhL1-D以驗(yàn)證上游片段的整合；設(shè)計(jì)引物ldhL1-U/Kr-D以驗(yàn)證中游片段的整合；在下同源臂PB下游設(shè)計(jì)引物P2-D，結(jié)合Kr-U以驗(yàn)證下游片段的整合。PCR擴(kuò)增結(jié)果用0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4。

圖4 不同引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Results of PCR amplification using different primers

由圖4可知，提取轉(zhuǎn)化子的基因組作為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，上游引物P1-U/ldhL1-D的PCR產(chǎn)物可看到一條2 800 bp左右的特異性條帶；中游引物ldhL1-U/Kr-D的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條2 900 bp左右的特異性條帶；下游引物Kr-U/P2-D的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條4 000 bp左右的特異性條帶，出發(fā)菌株AY12-α型單倍體的陰性對(duì)照無條帶，說明重組盒PA-ldhL1-PGK1T-KanMX-PB片段已成功重組到釀酒酵母AY12-α基因組中，并且重組位置也正確。

2.1.3 轉(zhuǎn)化子篩選標(biāo)記的去除

去掉突變株基因組上的KanMX抗性基因后，得到遺傳霉素抗性丟失的重組菌株P(guān)并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 重組菌株P(guān)的生長(zhǎng)性能測(cè)定

出發(fā)菌株AY12-α和重組菌株P(guān)的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 出發(fā)菌株AY12-α和重組菌株P(guān)生長(zhǎng)性能的比較Fig.5 Comparison of growth performance of original strain AY12-α and recombinant strain P

從圖5可以看出，與出發(fā)菌株AY12-α相比，重組菌株P(guān)的整體生長(zhǎng)趨勢(shì)與出發(fā)菌株基本保持一致（P＜0.05），生物量最終能夠達(dá)到與出發(fā)菌株AY12-α相同的水平，到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)重組菌株P(guān)的生物量略低。結(jié)合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)確定乳酸產(chǎn)生，結(jié)果表明，重組菌株P(guān)代謝產(chǎn)生的乳酸對(duì)菌株的生長(zhǎng)基本沒有影響。

2.3 重組菌株P(guān)的基本發(fā)酵性能測(cè)定

將親本AY12-α與重組菌株P(guān)同時(shí)進(jìn)行玉米水解液發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定各菌株的基本發(fā)酵性能，結(jié)果見表3。

表3 出發(fā)菌株AY12-α和重組菌株P(guān)的發(fā)酵性能比較Table 3 Comparison of fermentation performance of original strain AY12-α and recombinant strain P

由表3可知，過表達(dá)ldhL1基因的重組菌株P(guān)與出發(fā)菌株AY12-α在相同條件下CO2總質(zhì)量損失、還原糖含量等主要發(fā)酵性能沒有明顯變化（P＜0.05），乙醇產(chǎn)量稍有降低但不是很明顯（P＞0.05），表明過表達(dá)ldhL1基因?qū)甑陌l(fā)酵性能沒有太大影響。

同時(shí)，過表達(dá)ldhL1基因的重組菌株P(guān)的L-乳酸產(chǎn)量達(dá)12.64 g/L，而乙醇的產(chǎn)量有所降低，這是由于乳酸脫氫酶代謝途徑的引入，使得糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸在厭氧發(fā)酵過程中部分分流流向了L-乳酸。最大理論值為每克葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生0.51g乙醇，最大理論值為每克葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生1.0 g乳酸，實(shí)驗(yàn)測(cè)得發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為172.30 g/L，親本菌株AY12-α和重組菌株P(guān)的乙醇對(duì)葡萄糖產(chǎn)率分別為0.47 g/g和0.42 g/g，乙醇產(chǎn)率結(jié)果差異不顯著（P＞0.05），同時(shí)重組菌株P(guān)的L-乳酸對(duì)剩余葡萄糖產(chǎn)率為0.41 g/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了COLOMBIE S等[18]在釀酒酵母中整合過表達(dá)植物乳桿菌ldhL1基因可以達(dá)到積累L-乳酸的結(jié)論。

2.4 產(chǎn)乳酸菌株與外源添加乳酸發(fā)酵產(chǎn)乳酸乙酯的差異

為了比較出發(fā)菌株AY12-α與重組菌株P(guān)對(duì)乳酸的利用能力，在出發(fā)菌株AY12-α可以耐受乳酸的濃度范圍下對(duì)其進(jìn)行了添加乳酸的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。由前述可知重組菌株P(guān)的乳酸產(chǎn)量達(dá)12 g/L，為不加乳酸發(fā)酵的陰性對(duì)照。

2.4.1 乳酸添加量的確定

用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度為OD600nm=1.0，10倍梯度稀釋，依次取2 μL分別點(diǎn)滴于添加1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、6.0%乳酸的YEPD平板。結(jié)果如圖6所示。

圖6 出發(fā)菌株AY12-α的乳酸耐受性Fig.6 Lactic acid tolerance of original strain AY12-α

由圖6可知，乳酸添加量為1.0%～3.0%時(shí)，菌株AY12-α的菌落形態(tài)正常，基本不影響菌體的生長(zhǎng)；當(dāng)乳酸添加量提高至3.5%時(shí)，菌濃較低時(shí)菌落形態(tài)明顯發(fā)生變化，因此菌株AY12-α對(duì)乳酸的耐受濃度為3.5%。因此添加與產(chǎn)乳酸菌株相同水平的乳酸（添加量為1.0%，質(zhì)量濃度為12g/L）基本不會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)。

2.4.2 添加乳酸發(fā)酵性能比較

以不加乳酸的出發(fā)菌株AY12-α和重組菌株P(guān)作為對(duì)照，對(duì)出發(fā)株AY12-α添加12g/L的乳酸進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定各菌株的基本發(fā)酵性能，結(jié)果見表4。

由表4可知，添加12 g/L的乳酸進(jìn)行發(fā)酵，與重組菌株P(guān)的CO2總質(zhì)量損失和乙醇產(chǎn)量差異不顯著（P＞0.05），說明乳酸的添加沒有明顯影響酵母菌株的生長(zhǎng)。同時(shí)，發(fā)酵液中菌株AY12-α的乳酸含量基本保持不變，表明外源添加的乳酸大部分以游離的形式存在。

表4 添加乳酸后發(fā)酵性能比較Table 4 Comparison of fermentation performance after adding lactic acid

表5 添加乳酸對(duì)高級(jí)醇和酯含量的影響Table 5 Effect of adding lactic acid on the contents of higher alcohols and esters mg/L

由表5可知，產(chǎn)乳酸的重組菌株P(guān)其乳酸乙酯產(chǎn)量為162.75 mg/L，乳酸到乳酸乙酯的轉(zhuǎn)化率為1.04%；菌株AY12-α不添加乳酸進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè)不到乳酸乙酯的產(chǎn)生；添加與重組菌株P(guān)產(chǎn)量相同的乳酸含量（12 g/L），出發(fā)株AY12-α的乳酸乙酯產(chǎn)量達(dá)115.47 mg/L，僅為產(chǎn)乳酸菌株P(guān)的71%，結(jié)果差異顯著（P＜0.05），表明重組菌株P(guān)胞內(nèi)乳酸較胞外添加乳酸對(duì)乳酸乙酯的合成更具優(yōu)勢(shì)。結(jié)果表明過表達(dá)ldhL1基因使發(fā)酵的代謝流由乙醇部分流向了L-乳酸，胞內(nèi)產(chǎn)生的L-乳酸作為一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，在酵母的胞內(nèi)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成乳酸乙酯。釀酒酵母本身對(duì)乳酸具有一定的化學(xué)作用，但是這種效果較自身產(chǎn)乳酸的重組菌株P(guān)低，這可能是由于外源乳酸進(jìn)入胞內(nèi)部分被細(xì)胞膜所阻礙，胞內(nèi)自身產(chǎn)生的乳酸濃度高且更容易被胞內(nèi)酶所催化使重組菌株P(guān)的乳酸乙酯含量較高。同時(shí)重組菌株P(guān)的總高級(jí)醇（正丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇）的含量降低至118.11 mg/L，而出發(fā)菌AY12-α的總高級(jí)醇含量為225.79 mg/L，降低了約47.7%。

3 結(jié)論

與添加相同濃度乳酸的出發(fā)菌株AY12-α發(fā)酵相比，實(shí)驗(yàn)得到產(chǎn)L-乳酸酵母菌株，其乳酸乙酯的產(chǎn)量明顯提高（P＜0.05），達(dá)162.75mg/L。可以進(jìn)一步結(jié)合啟動(dòng)子工程，代謝工程等操作技術(shù)，進(jìn)一步協(xié)調(diào)乳酸與乙醇、乳酸與乳酸乙酯的比例，為米香型白酒機(jī)械化生產(chǎn)技術(shù)革新提供了一種新型酵母菌，有效避免窖泥微生物代謝產(chǎn)生的異味物質(zhì)對(duì)白酒風(fēng)味不利的影響。

產(chǎn)乳酸酵母的構(gòu)建也為進(jìn)一步提高乳酸乙酯產(chǎn)量奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，由此可以進(jìn)一步構(gòu)建乳酸到乳酸乙酯的酶催化反應(yīng)通路，得到高產(chǎn)乳酸乙酯酵母菌株以用于白酒工業(yè)生產(chǎn)。