水開(kāi)菲爾粒發(fā)酵香蕉皮過(guò)程中成分變化研究

翟苗苗，歐陽(yáng)信，李夢(mèng)茹，2，段 杉*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.美國(guó)英狄士化學(xué)公司廣州代表處，廣東 廣州 510000）

香蕉是熱帶亞熱帶地區(qū)大量種植的水果，香蕉皮通常被當(dāng)作垃圾丟棄，這不僅污染環(huán)境還造成資源的浪費(fèi)。其實(shí)，香蕉皮中除了含有大量的果膠、粗纖維等多糖成分外，還含有維生素C、多酚以及K、Ca、Mg、S、Fe、Zn等多種礦物質(zhì)[1]，此外，香蕉皮中還含有大量以糖苷形式存在的香氣前體成分等，值得開(kāi)發(fā)利用。

水開(kāi)菲爾粒是由乳桿菌為主，包括醋酸菌和酵母菌在內(nèi)的多種細(xì)菌和真菌共同構(gòu)成的共生菌系，它們之間通過(guò)某些細(xì)菌分泌的多糖結(jié)合在一起形成顆粒[2]。世界上許多地區(qū)都有用水開(kāi)菲爾粒發(fā)酵糖水、水果等制作飲料的習(xí)慣[3]，這些飲料在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量益生菌[4]、多糖、有機(jī)酸，具有抑制病原微生物[5]、抗炎[6]、提高免疫力[7]等功效。由于水開(kāi)菲爾粒的菌系復(fù)雜，其發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生多種多樣的酶，對(duì)底物的水解作用更強(qiáng)，不僅能夠水解多糖類(lèi)成分，也可以水解以糖苷形式存在的風(fēng)味前體成分，釋放出誘人的果香，菌系自身也會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜、協(xié)調(diào)的香氣成分，并產(chǎn)生各種具有保健功效的次級(jí)代謝產(chǎn)物，保健作用更強(qiáng)，發(fā)酵剩余的粗纖維等不溶性沉淀成分則可以用于制作膳食纖維。近年來(lái)的研究大多是關(guān)于香蕉皮中的功能性成分的提取與利用，鮮見(jiàn)采用香蕉皮發(fā)酵制作飲料的相關(guān)文獻(xiàn)。

本研究采用水開(kāi)菲爾粒發(fā)酵香蕉皮，研究了發(fā)酵過(guò)程中各種成分的變化，旨在開(kāi)發(fā)香蕉皮飲料，擴(kuò)大香蕉皮的綜合利用途徑，提高香蕉深加工幅度，增加香蕉生產(chǎn)附加值，減少環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

香蕉皮、水開(kāi)菲爾粒：市售；紅糖：廣東南字科技股份有限公司。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；硫酸：廣州市東紅化工廠(chǎng)；酚酞：沈陽(yáng)市試劑三廠(chǎng)；FL試劑（熒光素鈉）、2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2'-azobis（2-methylpropi onamidine）dihydrochloride，AAPH）、Trolox（水溶性維生素）：美國(guó)Sigma公司；磷酸氫二鉀：汕頭市光華化學(xué)廠(chǎng)；蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10 pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海滬南科學(xué)儀器有限公司；JA2003電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RHB80糖度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DPX-9082B-2電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 香蕉皮的發(fā)酵

將香蕉皮切成小塊后打漿，打漿后的香蕉皮分為兩份，一份在蒸鍋內(nèi)蒸15 min，破壞香蕉皮的組織結(jié)構(gòu)，蒸煮后冷卻待用，另一份不做任何處理；按紅糖、香蕉皮、水、水開(kāi)菲爾粒的質(zhì)量比為1∶3∶10∶0.5發(fā)酵，其中，水開(kāi)菲爾粒預(yù)先用無(wú)菌紗布包好，待用；紅糖預(yù)先與水按1∶10的比例配制好，然后煮沸5 min滅菌，冷卻。最后分別將上述兩份香蕉皮漿、紅糖水和水開(kāi)菲爾粒混合，裝入無(wú)菌三角瓶中，瓶口外覆8層紗布，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵，至發(fā)酵液的pH不變時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

采用烘干法測(cè)定香蕉皮發(fā)酵后剩余的沉淀物的干質(zhì)量以及原料香蕉皮干質(zhì)量，在105℃烘干至恒質(zhì)量后，香蕉皮利用率計(jì)算公式如下：

1.3.2 分析檢測(cè)

采用pH計(jì)測(cè)定pH值；采用糖度計(jì)測(cè)定糖度；滴定酸度的測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB5009.239—2016[8]《食品酸度的測(cè)定》中的酚酞指示劑法；乙醇含量的測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中的濃縮果汁中乙醇的測(cè)定方法[9]?？寡趸钚缘臏y(cè)定按照續(xù)潔琨等[10]報(bào)道的氧化自由基吸收能力（oxygenradicalabsorbancecapacity，ORAC）法。分別按照國(guó)標(biāo)GB 4789.2—2016《菌落總數(shù)測(cè)定方法》[11]、國(guó)標(biāo)GB 4789.35—2016《乳酸菌檢驗(yàn)》中的乳桿菌檢驗(yàn)方法[12]、國(guó)標(biāo)GB 4789.15—2016《霉菌和酵母計(jì)數(shù)方法》[13]檢測(cè)菌落總數(shù)、乳桿菌數(shù)量和真菌數(shù)量。

1.3.3 香蕉皮原料及發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分的測(cè)定

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測(cè)定香蕉皮原料及發(fā)酵液揮發(fā)性成分。

（1）揮發(fā)性氣體成分的收集

采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HP-SPME）法收集揮發(fā)性氣體成分，取10 mL未煮和煮過(guò)的香蕉皮發(fā)酵液分別置于萃取瓶中，萃取頭的材料型號(hào)為PDMA/DVB，將萃取頭插入萃取瓶中，使之懸空，萃取溫度45℃，萃取時(shí)間30 min，解吸時(shí)間15 min。在設(shè)定的條件下萃取得到揮發(fā)性氣體成分。

（2）香氣成分的測(cè)定

氣相色譜條件：DB-5色譜柱（30 m×0.25 nm×0.25 μm），載氣為氦氣（He），流速1.0mL/min，不分流進(jìn)樣，恒壓35kPa，爐溫45℃，進(jìn)樣口溫度250℃，起始溫度為35℃，保持5 min，后以3℃/min升溫至225℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，電離方式電子電離（electronic ionization，EI），電子能量70 eV，燈絲電流150 μA，掃描質(zhì)譜范圍33～450 amu。

定性定量方法：樣品經(jīng)過(guò)氣相色譜分離后，利用安捷倫質(zhì)譜處理系統(tǒng)結(jié)合美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)對(duì)總離子流色譜圖中各峰進(jìn)行檢索，確定每個(gè)峰對(duì)應(yīng)的化合物，并用峰面積歸一法計(jì)算各化合物的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉皮發(fā)酵過(guò)程中的pH值和糖度變化

香蕉皮發(fā)酵過(guò)程中的pH值和糖度變化如圖1所示。

由圖1A可知，香蕉皮是否經(jīng)過(guò)蒸煮對(duì)發(fā)酵過(guò)程的pH值沒(méi)有影響，在0～48 h之間煮過(guò)和未煮過(guò)的香蕉皮發(fā)酵液的pH值下降迅速，從初始的5.47分別下降至3.90和3.87；之后二者下降很緩慢，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別為3.53和3.51。

由圖1B可知，蒸煮香蕉皮發(fā)酵液的糖度高于未蒸煮的，發(fā)酵結(jié)束時(shí)二者的糖度分別為2.7%和2.2%。推測(cè)香蕉皮煮過(guò)后組織結(jié)構(gòu)被破壞，所含多糖等成分更易被水解釋放到發(fā)酵液中，導(dǎo)致蒸煮香蕉皮發(fā)酵液的糖度更高。發(fā)酵液的糖度也是在0～48 h之間迅速下降，此后變化較小。結(jié)合圖1A可知，在0～48 h之間糖度變化與pH變化同步。水開(kāi)菲爾粒中的微生物主要是各種乳桿菌，還有一些醋酸菌和酵母菌，乳桿菌會(huì)將大量糖類(lèi)轉(zhuǎn)化為乳酸，一些乳酸菌還會(huì)利用環(huán)境中的糖合成構(gòu)成開(kāi)菲爾粒的多糖；酵母菌會(huì)將部分糖轉(zhuǎn)化為乙醇，醋酸菌則將乙醇進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酸。推測(cè)在此時(shí)間范圍內(nèi)糖度迅速下降可能是由于微生物的代謝活動(dòng)旺盛，大量產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸以及少量乙醇和多糖。到了發(fā)酵的中后期，糖度的變化較小，而pH持續(xù)緩慢下降，推測(cè)這是因?yàn)榘l(fā)酵初期產(chǎn)生的大量有機(jī)酸導(dǎo)致環(huán)境pH顯著下降，微生物的代謝活動(dòng)被大大抑制，產(chǎn)生有機(jī)酸的速度大大降低所致；而糖度變化較小推測(cè)可能是由于一方面微生物消耗糖的速度大大降低，另一方面香蕉皮中的果膠等多糖類(lèi)物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中緩慢發(fā)生水解，釋放出低分子糖類(lèi)，這樣糖的消耗和產(chǎn)生基本持平。

圖1 香蕉皮發(fā)酵過(guò)程中的pH值(A)和糖度(B)變化Fig.1 Changes of pH value(A)and sugar contents(B)in banana peel during fermentation process

2.2 香蕉皮發(fā)酵液的成分分析

香蕉皮經(jīng)240 h發(fā)酵后，測(cè)定香蕉皮的利用率，并分析發(fā)酵液中各種成分含量，結(jié)果如表1所示。微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 香蕉皮利用率及發(fā)酵液的各種成分含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of utilization rates of banana peel and the contents of various ingredients in fermentation broth

由表1可知，蒸煮香蕉皮利用率為43.8%，未蒸煮香蕉皮利用率為32.4%，可能是由于經(jīng)過(guò)蒸煮香蕉皮中的多糖、果膠等被釋放出來(lái)，更易于被細(xì)菌和真菌利用。蒸煮香蕉皮發(fā)酵液的滴定酸度為54.9mmol/100mL，未蒸煮香蕉皮為50.9 mmol/100 mL，相差不大；蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中乙醇含量為2.8 mg/mL，低于未蒸煮香蕉皮7.9 mg/mL。

表2 香蕉皮發(fā)酵液的微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of microbiological indexes in fermentation broth of banana peel

由表2可知，二者的乳桿菌和細(xì)菌總數(shù)相差不大均在5.4～5.5 lg（CFU/mL）左右，而蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中真菌數(shù)為3.6 lg（CFU/mL），低于未蒸煮的4.0 lg（CFU/mL），水開(kāi)菲爾粒發(fā)酵液中的真菌為酵母菌，故推測(cè)可能是由于蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中酵母菌數(shù)量較少，導(dǎo)致產(chǎn)生的乙醇較少。乳桿菌數(shù)與細(xì)菌菌落總數(shù)基本一致，可見(jiàn)在發(fā)酵液的微生物中乳桿菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與CORONAO等[14]的研究結(jié)果一致。

ORAC值反映抗氧化活性的強(qiáng)弱，蒸煮香蕉皮發(fā)酵液的ORAC值為3.58mmolTrolox/L，低于未蒸煮香蕉皮5.03mmol Trolox/L，推測(cè)這是因?yàn)樵谡糁筮^(guò)程中香蕉皮原料中的天然抗氧化成分有所破壞導(dǎo)致，但仍有一定的抗氧化活性。

2.3 香蕉皮中揮發(fā)性成分分析

對(duì)香蕉皮原料及其發(fā)酵液的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，結(jié)果如表3所示。

表3 香蕉皮原料及其發(fā)酵液中的揮發(fā)性成分GC-MS分析Table 3 GC-MS analysis of volatile components in banana peel and its fermentation broth

由表3可知，從香蕉皮原料中共鑒定9種揮發(fā)性成分，分別為丁酸-2-甲基丙酯/丁酸異丁酯、丁酸丁酯、丁酸-1-甲基丁酯、3-甲基-丁酸丁酯/異戊酸丁酯、丁酸-3-甲基丁酯/丁酸異戊酯、3-甲基-丁酸-3-甲基丁酯/異戊酸異戊酯、2-甲基-丙酸己酯/異丁酸己酯、β-柏木烯、7,11-二甲基-3-亞甲基-1,6,10-十二碳三烯。這9種成分占全部揮發(fā)性成分的95.05%，而其中僅丁酸酯類(lèi)就占92.05%，可見(jiàn)，香蕉皮原料的揮發(fā)性成分主要是丁酸酯類(lèi)。

未蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中鑒定出9種揮發(fā)性成分，分別為乙酸、乙酸-3-甲基丁酯/乙酸異戊酯、芳樟醇、辛酸/羊脂酸、辛酸乙酯、2-莰烯、乙酸苯乙酯、突厥烯酮、癸酸乙酯。其含量占全部揮發(fā)性成分的87.13%。從蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中檢出28種揮發(fā)性成分，鑒定出其中的9種，分別為乙酸、乙酸-3-甲基丁酯/乙酸異戊酯、芳樟醇、辛酸/羊脂酸、辛酸乙酯、2-莰烯、乙酸苯乙酯、突厥烯酮、2,5-二叔丁基酚。其含量占全部揮發(fā)性成分的83.49%。在鑒定出的揮發(fā)性成分中，未蒸煮和蒸煮香蕉皮僅有1種成分不同，且其占比僅略超過(guò)1%，這說(shuō)明二者的揮發(fā)性成分是相近的。

由表3可知，從香蕉皮原料中鑒定出的9種揮發(fā)性成分經(jīng)過(guò)發(fā)酵后全部消失，說(shuō)明發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的變化很大，感官評(píng)定也表明香蕉皮經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生了濃郁的水果香氣，與原料的氣味差異極大。陶晨等[15]從香蕉中鑒定出39種揮發(fā)性成分，其中酯類(lèi)占66.99%，包括異戊酸2-甲基丁酯、丁酸異戊酯和丁酸己酯等，與本研究結(jié)果相似。張文燦等[16]發(fā)現(xiàn)乙酸異戊酯在香蕉果肉和果皮中分別占揮發(fā)性成分的27.23%和4.67%，本研究在香蕉皮原料中未檢測(cè)到乙酸異戊酯，但在未蒸煮和蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中檢測(cè)到其含量分別達(dá)到34.15%和15.76%，除乙酸外，含量占第一位，推測(cè)該成分在香蕉皮原料中可能以糖苷類(lèi)香氣前體成分的形式存在，無(wú)揮發(fā)性，發(fā)酵后游離出來(lái)。本研究在香蕉皮原料中檢測(cè)到的丁酸異丁酯（2.15%）、丁酸丁酯（6.34%）、丁酸-1-甲基丁酯（17.20%）、丁酸異戊酯（65.40%）等幾種主要揮發(fā)性成分也均在張文燦等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)，但含量不同，這可能與成熟度、品種等差異有關(guān)。乙酸苯乙酯未在香蕉皮原料中檢出，但在未蒸煮和蒸煮香蕉皮發(fā)酵液中除乙酸外其含量占第二位，分別達(dá)到5.78%和10.00%。

前期研究[17]發(fā)現(xiàn)在水開(kāi)菲爾粒的微生物群落中存在多種多樣的糖苷酶基因，而大量的水果香氣成分是以糖苷類(lèi)的前體物形式存在的，推測(cè)用水開(kāi)菲爾粒發(fā)酵香蕉皮，可以有效水解糖苷類(lèi)物質(zhì)，將大量的香氣成分釋放出來(lái)，獲得良好的水果香氣，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這種推測(cè)。

水開(kāi)菲爾粒中的糖苷酶也包括了水解果膠、纖維素等物質(zhì)的糖苷酶，所以香蕉皮經(jīng)過(guò)發(fā)酵后相當(dāng)一部分固形物被水解釋放到發(fā)酵液中。發(fā)酵剩余的殘?jiān)饕窍憬镀ぶ械睦w維素一類(lèi)的成分，經(jīng)過(guò)清洗干燥可以作為膳食纖維補(bǔ)充劑。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)用水開(kāi)菲爾粒對(duì)蒸煮和未蒸煮香蕉皮發(fā)酵，探討香蕉皮發(fā)酵過(guò)程中各種成分的變化。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示香蕉皮發(fā)酵前后香氣成分變化極大，發(fā)酵后香氣大大增強(qiáng)。盡管蒸煮香蕉皮的發(fā)酵液比未蒸煮抗氧化活性有所降低，但仍具有一定的抗氧化活性，而且蒸煮香蕉皮利用率43.8%高于未蒸煮香蕉皮32.4%，乙醇含量2.8 mg/mL低于未蒸煮香蕉皮7.9 mg/mL。水開(kāi)菲爾粒發(fā)酵蒸煮香蕉皮，發(fā)酵液風(fēng)味良好，類(lèi)似果醋，有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為新型飲料。