濃香型白酒窖泥中乳酸菌的分離鑒定及其在柑橘酒中的應(yīng)用

沈 馨，馬佳佳，劉文匯，楊少勇，張振東，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.湖北古襄陽酒業(yè)有限公司，湖北 襄陽 441100）

作為柑橘深加工的重要領(lǐng)域，以柑橘為原料進(jìn)行果酒釀制，不僅促進(jìn)了柑橘產(chǎn)業(yè)的多元化發(fā)展，而且提高了農(nóng)產(chǎn)品的附加值[1]。雖然柑橘酒富含有機(jī)酸和維生素等多種營養(yǎng)成分，但其存在酸味和苦味偏重的不足[2]，在一定程度上降低了消費(fèi)者對產(chǎn)品的喜好程度，因而積極尋求改善柑橘酒口感的方法是極為必須的。

果酒發(fā)酵過程中適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)酸可平衡酒中的苦澀味，而有機(jī)酸含量過高亦會導(dǎo)致果酒口感酸澀[3]。目前研究人員多采用工藝優(yōu)化的方法，通過添加蔗糖[4]和糯米粉[5]的方式改善柑橘酒的風(fēng)味。通過將蘋果酸分解為乳酸同時引起其他有機(jī)酸的變化，在果酒發(fā)酵過程中添加乳酸菌亦可顯著改善果酒的口感[6]。作為濃香型白酒窖泥中的重要功能菌群，適當(dāng)?shù)娜樗峋a(chǎn)生的乳酸除具有調(diào)和酒味的緩沖功能外，亦可與酒精生成乳酸乙酯，具有提升濃香型白酒品質(zhì)的作用[7]。除此之外，窖泥中的乳酸菌具有較強(qiáng)的酒精耐受性[8]，因而從濃香型白酒窖泥中分離乳酸菌并對其在柑橘酒中的應(yīng)用潛力進(jìn)行評價是較為可行的。

在對濃香型白酒窖泥中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，將其與酵母菌聯(lián)合發(fā)酵進(jìn)行柑橘酒制備，采用電子舌對柑橘酒滋味品質(zhì)進(jìn)行評價的同時，使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對柑橘酒中有機(jī)酸的種類和含量進(jìn)行了解析，通過本研究的實(shí)施以期為后續(xù)柑橘酒相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘（品種為宮川）、白砂糖：市售；果膠酶（50000U/g）：和氏壁生物技術(shù)有限公司；偏高活性葡萄酒果酒干酵母（其中菌株為釀酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；牛肉膏、酵母膏、檸檬酸銨、吐溫-80、瓊脂、葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、蛋白胨、檸檬酸二銨、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、氯化鈉、酚、異戊醇、氯仿、乙酸鈉、乙醇、乙二胺四乙酸、碳酸鈉和碳酸鈣：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）聚合酶、2×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）mix、10×PCR buffer和T-載體：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物（27F/1495R）：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；內(nèi)部液、參比溶液、陰離子溶液和陽離子溶液：日本Insent公司；草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1100紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；250B數(shù)顯生化培養(yǎng)箱：金壇市榮華儀器制造有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DG250厭氧工作站：英國DWS公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國AB公司；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國FluorChem公司；LC-20ADXR高效液相色譜儀及Inertsil ODS-SP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）：日本島津公司；SA-402B電子舌（配置CA0、C00、AE1、CT0和AAE測試傳感器）：日本Insent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

從湖北古襄陽酒業(yè)的窖泥車間隨機(jī)選取3個窖池，編號分別為A、B和C，從每個窖池的上層（距地面20 cm）、中層和底層分別挖取100 g左右窖泥，同一窖池的窖泥混合均勻后裝入樣品瓶中，置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行乳酸菌的分離。

1.3.2 窖泥乳酸菌的分離純化及DNA提取

將窖泥樣品10倍梯度稀釋后，取3個適宜的梯度涂布于含有1%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)2 d，選取菌數(shù)在30～300之間的梯度進(jìn)行菌落形態(tài)記錄。取有透明圈的單菌落劃線，純化3次之后，進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。將過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性和革蘭氏染色結(jié)果為陽性的純菌株暫定為疑似乳酸菌[9]。使用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法對菌株基因組DNA進(jìn)行提取[10]，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 16S rDNA的PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增體系：正反向引物各0.5μL，模板0.5μL，dNTP2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，Taq酶0.2μL，超純水18.8μL。其中正反向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物為1495R：5'-CTACGGCTACCTTCTTACGA-3'[11]。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min；4℃保溫[11]。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將擴(kuò)增成功的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接、轉(zhuǎn)化以及鑒定，并將鑒定出的陽性克隆子的菌液寄往南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測出的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對[12]，以確定其分子學(xué)地位，并使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株乙醇耐受性的測定

將活化3代的菌株分別接種于乙醇含量分別為0、3%、5%、7%的MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃的條件下培養(yǎng)48 h后，在波長600 nm處測定其OD600nm值。

1.3.5 柑橘酒的制作

將成熟的柑橘去皮、分瓣和打漿裝入1 L玻璃瓶中→添加偏重亞硫酸鉀（90 mg/L）→添加100 mg/L果膠酶→用碳酸鈉調(diào)pH值為6.0，用白砂糖調(diào)整糖度為20°Bx→常溫放置12 h→添加200 mg/L干酵母→控溫發(fā)酵（22℃，6 d）→酒渣分離→按照5×106CFU/mL柑橘酒的接種量接種乳酸菌→后發(fā)酵（18℃，20 d）→陳釀→澄清→過濾→殺菌→裝瓶

1.3.6 柑橘酒滋味品質(zhì)的評價

參照郭壯等[13]的方法進(jìn)行測定。傳感器CAO、AE1、COO、AAE和CTO首先測得參比溶液電勢Vr，然后測得柑橘酒的電勢Vs，在參比溶液中洗滌后，傳感器COO、AE1和AAE測得參比溶液電勢Vr'。Vs-Vr即為酸、苦、澀、咸和鮮味5個基本味的相對強(qiáng)度；Vr-Vr'即為柑橘酒后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）的相對強(qiáng)度。

1.3.7 柑橘酒有機(jī)酸的測定

將乳酸、草酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸和蘋果酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品用超純水配制成0.001～3 g/L的梯度，根據(jù)有機(jī)酸濃度和色譜峰峰面積進(jìn)行線性擬合。

樣品處理：取2 mL樣品加200 μL磷酸，流動相定容至10 mL，混勻后用0.22 μm水相濾膜過濾備用。

色譜條件：流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH2.9），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL，色譜柱為C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），檢測器為紫外檢測器，檢測波長為215 nm[14-15]。

1.3.8 柑橘酒理化指標(biāo)的評價

使用Mega7.0 軟件（http：//www.megasoftware.net/）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，其他圖均使用Origin 8.6軟件（OriginLab Corp，MA，USA）繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA同源性分析

從窖泥樣品中共分離出15株疑似乳酸菌菌株，顯微鏡下觀察均為短桿，所有菌株的菌落均為圓形、顏色為乳白色且邊緣光滑整齊。所有菌株過氧化氫酶均為陰性，革蘭氏染色均為陽性。在提取疑似乳酸菌菌株DNA基礎(chǔ)上，本研究通過16S rDNA同源性分析對15株疑似乳酸菌菌株進(jìn)行了鑒定，進(jìn)而確定了其分類學(xué)地位，15株菌16S rDNA序列分析結(jié)果如表1所示。

表1 15株菌的16S rDNA序列分析結(jié)果Table 1 16S rDNA sequence analysis of 15 strains

由表1可知，15株疑似乳酸菌均被鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），且與L.paracaseiR094 16S rDNA序列同源性均為99%，由此可見，L.paracasei是古襄陽窖泥中的優(yōu)勢乳酸菌。

在已知同源性比對結(jié)果的基礎(chǔ)之上，本研究進(jìn)一步使用MEGA7.0軟件以鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，標(biāo)準(zhǔn)序列中包括作為系統(tǒng)發(fā)育樹外群序列的L.brantaeSL1108和L.curvatusJCM 1096以及系統(tǒng)發(fā)育樹外群序列的L.zeaeRIA 482和L.rhamnosusNBRC 3425，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 15株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 15 lactic acid bacteria strains

由圖1可知，15株菌株和2株內(nèi)群菌株形成了第一類群，而外群菌L.brantaeSL1108和L.curvatusJCM1096分別形成了第二類群和第三類群，且15株菌株的16S rDNA序列同源性均為99%，均鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。

2.2 窖泥乳酸菌菌株乙醇耐受性的測定

在明確各菌株分類學(xué)地位的基礎(chǔ)之上，本研究評價了15株乳酸菌的乙醇耐受性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乳酸菌菌株酒精耐受試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Alcohol tolerance test results of lactic acid bacteria strains

由圖2可知，15株乳酸菌在含7%乙醇的MRS培養(yǎng)基中仍然可以生長，說明其具有較好的乙醇耐受性。隨著乙醇含量的升高，乳酸菌的生長受到了明顯的抑制（P＜0.05）。

2.3 柑橘酒滋味品質(zhì)的評價

為了進(jìn)一步研究添加乳酸菌對柑橘酒滋味品質(zhì)的影響，本研究采用電子舌技術(shù)對果酒各滋味指標(biāo)的相對強(qiáng)度值進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，添加乳酸菌后柑橘酒苦味、咸味、鮮味和豐度（鮮味的回味）相對強(qiáng)度呈現(xiàn)下降趨勢，澀味相對強(qiáng)度呈現(xiàn)上升趨勢，而酸味、后味A（澀味的回味）和后味B（苦味的回味）因使用菌株發(fā)酵特性的不同呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，這說明在后發(fā)酵過程中添加乳酸菌會顯著影響柑橘酒的滋味品質(zhì)。值得一提的是，酸味是15株乳酸菌發(fā)酵而成的柑橘酒樣品間差異最大的指標(biāo)，這可能與乳酸菌菌株產(chǎn)酸和蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力不同有關(guān)。為了進(jìn)一步探討添加乳酸菌對柑橘酒酸味的影響，采用HPLC技術(shù)對柑橘酒中的有機(jī)酸含量進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖4所示。

圖3 柑橘酒各滋味指標(biāo)的相對強(qiáng)度值Fig.3 Relative intensity of each taste index in orange wine

圖4 柑橘酒有機(jī)酸的種類和含量Fig.4 Types and contents of organic acids in orange wine

由圖4可知，柑橘酒中的有機(jī)酸主要是乳酸、檸檬酸和琥珀酸，添加乳酸菌可明顯提升果酒中乳酸的含量，并降低琥珀酸的含量。除此之外，添加乳酸菌的果酒中蘋果酸的含量也較對照組低，說明蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程可以將蘋果酸轉(zhuǎn)為乳酸。L.paracaseiJNC1-1、L.paracaseiJNB2-1、L.paracaseiJNB1-3和L.paracaseiJNB1-2可明顯降低7種有機(jī)酸的總含量，而L.paracaseiJNC2-1、L.paracaseiJNB2-2、L.paracaseiJNA2-3和L.paracaseiJNA2-1可提高果酒中乳酸菌的含量。由此可見，不同乳酸菌菌株的發(fā)酵特性是具有較大差異的。

在解析果酒各滋味指標(biāo)相對強(qiáng)度和有機(jī)酸差異的基礎(chǔ)之上，本研究采用主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）對果酒滋味品質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步評價，柑橘酒滋味品質(zhì)的因子載荷圖如圖5所示。

圖5 柑橘酒滋味品質(zhì)的因子載荷圖Fig.5 Factor loading graph of taste quality in orange wine

由圖5可知，第一主成分由咸味和鮮味2個指標(biāo)組成，其貢獻(xiàn)率為88.95%；第二主成分由豐度（鮮的回味）、澀味、后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）、苦味和酸味6個指標(biāo)所組成，其貢獻(xiàn)率為8.50%。柑橘酒滋味品質(zhì)的主成分1與主成分2因子得分圖如圖6所示。

圖6 柑橘酒滋味品質(zhì)的因子得分圖Fig.6 Factor score graph of taste quality in orange wine

由圖6可知，在水平方向上，相對于對照組而言，添加乳酸菌的樣品在因子得分圖上的分布整體偏右，結(jié)合因子載荷圖可知，添加乳酸菌發(fā)酵后柑橘酒的鮮味和咸味減弱。L.paracaseiJNB1-3在空間排布上較之其他添加乳酸菌的樣品偏左上，結(jié)合因子載荷圖可知，添加該株菌可明顯降低柑橘酒的酸味和苦味。由此可見，L.paracaseiJNB1-3在后續(xù)柑橘酒發(fā)酵中可能具有一定的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

從濃香型白酒窖泥中共分離出了15株乳酸菌，經(jīng)鑒定均為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），為古襄陽酒業(yè)窖泥中的優(yōu)勢乳酸菌。柑橘酒中的有機(jī)酸主要為乳酸、檸檬酸和琥珀酸，酸味是15株乳酸菌發(fā)酵而成的柑橘酒樣品間差異最大的指標(biāo)。在后發(fā)酵過程中添加乳酸菌會顯著影響柑橘酒的滋味品質(zhì)，L.paracaseiJNB1-3可明顯降低柑橘酒的酸味和苦味，在后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)中可能具有一定的應(yīng)用潛力。