利福噴丁聯(lián)合氟康唑對耐藥白念珠菌細胞周期的影響

王玉連 袁公 陳雅楠 曹永兵 吳建華

(1.第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 200433)

近年來，隨著廣譜抗生素的不合理應用、激素的濫用、腫瘤的化學治療及器官移植后免疫抑制劑的大量應用，導致真菌感染呈上升趨勢，其中白念珠菌導致的真菌感染最常見 (36%)[1]。氟康唑因其口服吸收效果好，生物利用度高，副作用小，在臨

床上廣泛使用。但由于其長期過度使用，目前白念珠菌對氟康唑的耐藥率逐漸增加，導致臨床治療真菌感染失敗。

利福噴丁為利福霉素類抗生素，是治療結核病的一線用藥，抗結核桿菌作用比利福平強2～10倍，且同等劑量下對患者胃腸道刺激及肝功能損傷均小于利福平[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)利福噴丁對氟康唑抗耐藥白念珠菌有增效作用[3]，為進一步研究其增效作用機制，本實驗通過流式細胞儀檢測不同用藥組細胞內DNA含量變化，觀察利福噴丁、氟康唑單用及聯(lián)合用藥對耐藥白念珠菌細胞周期的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

主要儀器 5417R高速冷凍離心機 (Eppendorf FACSCalibur)；流式細胞儀 (美國BD公司)。

菌株 氟康唑耐藥白念珠菌100臨床分離株，由長海醫(yī)院真菌室提供，海軍軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心保存，經形態(tài)學及生化學鑒定，氟康唑MIC80≥256 μg/mL，菌株實驗前經沙氏培養(yǎng)基 (SDA)劃板活化，30℃培養(yǎng)24～48 h，以保證受試真菌的活力與純度，并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

藥物與試劑 利福噴丁 (美國melone公司，批號S0118A)，將利福噴丁用二甲基亞砜 (DMSO,Sigma公司)溶解為20 mg/mL，-20℃避光儲存?zhèn)溆?；氟康唑注射?(大扶康DIFLUCAN，輝瑞制藥有限公司，批號A075102，濃度2 mg/mL)，4℃儲存。碘化丙啶 (PI，Sigma產品)；RNAse (Sigma分裝) ；磷酸鹽緩沖液 (Phosphate Buffered Saline，PBS)：氯化鈉 (NaCl)8 g，氯化鉀 (KCl)0.2 g，磷酸氫二鈉 (Na2HPO4)0.133 g，磷酸二氫鉀 (KH2PO4)0.06 g，碳酸氫鈉 (NaHCO3)0.35 g，調整pH值為7.2，定容至1 000 mL，然后高壓蒸汽滅菌，置于4℃冰箱保存。

培養(yǎng)基 SDA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，調整pH值為7.0±0.1 (25℃)，定容至1 000 mL，高壓滅菌，4℃保存。RPMI 1640培養(yǎng)液：RPMI 1640粉末10 g，NaHCO32.0 g，三氮嗎啡啉丙磺酸鈉 (MOPS，Sigma)34.5 g，加三蒸水900 mL溶解，1 moL/L NaOH溶液調pH值為7.0±0.1 (25℃)，定容至1 000 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃保存。

1.2 方法

含藥RPMI 1640培養(yǎng)液的配制 利福噴?。菏紫葘⒗姸∮枚谆鶃嗧咳芙鉃?0 mg/mL藥物原液，然后用RPMI 1640培養(yǎng)液將上述藥物原液稀釋至利福噴丁濃度為250 μg/mL (2倍工作濃度)。氟康唑：將濃度為2 mg/mL氟康唑注射液用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至氟康唑濃度8 μg/mL (2倍工作濃度)。利福噴丁+氟康唑聯(lián)：取一定量的RPMI 1640培養(yǎng)液，分別加入20 mg/mL利福噴丁原液和2 mg/mL氟康唑注射液，配制成利福噴丁/氟康唑濃度為250/8 μg/mL (2倍工作濃度)。

白念珠菌的復蘇和菌懸液的配制 用接種環(huán)挑取SDA培養(yǎng)基上的單克隆菌落，接種到1 mL YEPD培養(yǎng)液中，于30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，活化24 h，使真菌處于指數(shù)生長期后期。取菌液10 μL再次接種到YEPD培養(yǎng)液1 mL中活化16 h，經3 000×g離心5 min，去上清液，取1 mL RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，然后用血球計數(shù)板計數(shù)，并用RPMI 1640培養(yǎng)液調整菌液濃為 (3～5)×106cell/mL (2倍工作濃度)。分別取配制好的藥物培養(yǎng)液500 μL加入新鮮配制的菌懸液500 μL于玻璃試管中，使利福噴丁的終濃度為125 μg/mL，氟康唑終濃度為4 μg/mL、合藥組 (利福噴丁/氟康唑)終濃度為125/4 μg/mL，同時取RPMI 1640培養(yǎng)液500 μL加入菌懸液500 μL作為生長對照組。將各組樣本放入30℃，200 r/min恒溫振蕩箱避光條件下分別培養(yǎng)24 h。每組平行做3個樣本。

固定、DNA染色、流式細胞儀檢測 將培養(yǎng)12 h的菌懸液移至1.5 mL的EP管中，5 000×g離心5 min，去上清液，加PBS重懸洗滌2次，加入預冷的70%無水乙醇放置于4℃冰箱，72 h后取出，加PBS洗滌，離心，用PBS重懸，計數(shù)，調整細胞數(shù)為1×106左右，取上述菌懸液400 μL，加入20 μL的RNAse (10 mg/mL)，使其工作濃度為500 μg/mL，充分混勻后于37℃水浴1 h，除去RNA，然后各組樣品中加入20 μL PI溶液 (1 mg/mL)染色，使其工作濃度為50 μg/mL，常溫避光條件下靜置30 min后，將各樣品分別移入進樣試管中, 每個樣品獲取2 000個細胞，F(xiàn)L2檢測通道，激發(fā)光波長為488 nm，檢測光為560～580 nm，對樣品進行單參數(shù)DNA含量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

本實驗通過流式細胞術檢測藥物作用12 h對耐氟康唑白念珠菌100細胞周期中各期DNA含量，探索利福噴丁、氟康唑單用及聯(lián)合用藥對耐藥白念珠菌100細胞周期的影響。

不同細胞周期DNA含量百分比統(tǒng)計結果顯示 (見圖1～2)：空白對照組、利福噴丁組、氟康唑組及合藥組在G0/G1期細胞計數(shù)百分比分別為：(76.41±1.52)%、(75.48±1.41)%、(72.36±1.01)%、(8.11±0.22)%，S期細胞計數(shù)百分比分別為：(5.46±0.73)%、(8.46±0.23)%、(6.86±0.56)%、(12.52±0.54)%, G2/M期細胞計數(shù)百分比分別為：(18.14±1.11)%、(16.06±1.37)%、(20.78±1.48)%、(79.37±0.52)%。G0/G1期：生長對照組、利福噴丁組及氟康唑組兩兩比較，其組間DNA含量均無明顯差異 (P>0.05)；聯(lián)合用藥組DNA含量較低，與生長對照組及單藥組相比，均有顯著性差異 (P<0.01)。S期：與生長對照組相比，氟康唑組DNA含量無差異 (P=0.224)，利福噴丁組 (P=0.043)、聯(lián)合用藥組 (P=0.01)DNA含量均有顯著性差異；利福噴丁、氟康唑單藥組與聯(lián)合用藥組兩兩比較顯示，利福噴丁組與氟康唑組之間DNA含量無差異 (P>0.086)，單藥組與聯(lián)合用藥組DNA含量均有顯著性差異 (P<0.01)。G2/M期：生長對照組、利福噴丁組及氟康唑組兩兩比較，其組間DNA含量均無明顯差異 (P>0.05)；聯(lián)合用藥組DNA含量明顯增加，與生長對照組及單藥組相比，均有顯著性差異 (P<0.01)。這說明聯(lián)合用藥組細胞周期阻滯在G2/M期，即聯(lián)合用藥可抑制白念珠菌的正常分裂增殖。

圖1 利福噴丁、氟康唑單用及兩藥合用12 h后耐藥白念珠菌各期細胞百分比 圖2 利福噴丁、氟康唑單用及兩藥合用12 h后耐藥白念珠菌胞內DNA含量變化

Fig.1 Histogram indicating the percentages of FLC-resistanceCandidaalbicanscells treated with different drugs for 12 h in cycle progress. Results are shown as mean±SD；***P<0.001 vs FCZ group；##P<0.01 vs RFT group，###P<0.001 vs RFT group Fig.2 DNA contents of FLC-resistanceCandidaalbicanscells treated with Fluconazole or Rifapentine alone and combination for 12 h

3 討 論

流式細胞術 (Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是一項發(fā)展迅速的新型生物醫(yī)學分析技術，因其檢測速度快、精確度高、靈敏度高等優(yōu)勢被廣泛應用于細胞內DNA含量的檢測。流式細胞儀檢測細胞內DNA含量的主要原理是用化學定量方式對細胞內DNA進行染色，DNA結合熒光染料后，在流式細胞儀內受激光激發(fā)而發(fā)出不同的熒光束，根據熒光強度區(qū)分細胞周期中各期DNA含量，可將檢測樣本細胞分為二倍體的G0/G1期，二倍體與四倍體之間的S期，四倍體的G2/M期。

細胞周期指從一次細胞分裂形成子細胞開始到下一次細胞分裂形成子細胞結束所經歷的過程。白念珠菌為真核細胞生物，其細胞周期分為G0期 (此期細胞處于停止分裂狀態(tài)，具有潛在分裂能力，細胞內是二倍體DNA)、G1期 (細胞有絲分裂完成到DNA復制之前的時期，又稱合成前期，細胞內是二倍體DNA)、S期 (DNA的合成期，是二倍體DNA到四倍體DNA的過程)、G2期 (DNA合成終止，為有絲分裂的準備期，此時細胞內含四倍體DNA)、M期 (細胞的有絲分裂期，此時細胞內為四倍體DNA)[4]。

本課題組前期藥敏試驗結果顯示：對多株耐藥白念珠菌臨床分離株，利福噴丁單用無抗菌活性，聯(lián)合用藥后利福噴丁的MIC80值由單用時的>1 024 μg/mL，下降至32～64 μg/mL，氟康唑的MIC80值由單用時的>64 μg/mL，下降至1～8 μg/mL，F(xiàn)ICI均<0.5，兩藥的相互作用為協(xié)同作用[3]。本實驗通過流式細胞儀檢測利福噴丁、氟康唑單用及聯(lián)合用藥細胞內DNA含量變化，觀察其對耐藥白念珠菌細胞周期的影響。結果顯示，利福噴丁、氟康唑單藥組與對照組相比無顯著差異，聯(lián)合用藥組G0/G1期DNA含量減少 (P<0.01)，G2/M期DNA含量顯著增加 (P<0.01)。氟康唑主要通過抑制白念珠菌麥角甾醇的合成，進而影響細胞膜的完整性發(fā)揮抑菌效應，因此其抗真菌機制與細胞周期無明顯關系。利福噴丁抗細菌作用機制主要是通過競爭性結合依賴DNA的RNA多聚酶β亞單位，阻礙細菌mRNA的合成，進而影響DNA及蛋白質合成，最終致細菌死亡[5]。

細胞的正常分裂增殖是一個極其復雜又精準過程，真核細胞能夠使細胞周期正確地開啟和結束，依賴于細胞內周期調控系統(tǒng)[6]。當細胞經藥物作用后，可發(fā)生DNA損傷，細胞會啟動細胞周期自查及修復，若細胞損傷被及時修復，則細胞周期繼續(xù)進入下一個階段。如果細胞損傷持續(xù)存在或損傷嚴重，無法被修復，則細胞周期將不能從一個階段進入下一個階段，這種現(xiàn)象稱為細胞周期阻滯[7-8]。G2/M期為細胞增長及有絲分裂期，在此期間，DNA合成停止，主要為RNA及蛋白質的合成，進而完成分裂增殖。本實驗結果提示聯(lián)合用藥組G2/M期DNA含量均顯著增加，這表明聯(lián)合用藥后大量細胞在G2/M期堆積，導致細胞無法進入下一個細胞周期。由此推測，由于利福噴丁分子量較大，無法直接透過真菌細胞壁或細胞膜直接對真菌造成損傷，與氟康唑合用時，可通過受損的細胞膜進入細胞內，發(fā)揮其協(xié)同抗菌作用。利福噴丁對白念珠菌的損傷不能被及時修復，為一種不可逆損傷，細胞無法進一步正常分裂增殖，細胞周期阻滯在G2/M期。Li等[9]和呂霞琳等[10]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿、漢防己甲素聯(lián)合氟康唑對耐藥白念珠菌細胞周期也有一定的阻滯作用。目前，尚未見關于利福噴丁對白念珠菌細胞周期影響的文獻報道。本實驗表明利福噴丁和氟康唑聯(lián)合用藥時對耐藥白念珠菌的細胞周期有阻滯作用，具體作用機制有待進一步研究驗證。