血漿(1-3)-β-D葡聚糖對院內(nèi)侵襲性真菌感染診斷的臨床價(jià)值

尚元元 喻楠 董靈娣 李莎莎 劉昱奚

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚科，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，銀川 750004)

侵襲性真菌感染 (IFI)是指致病性真菌向組織內(nèi)侵入、增殖所致的真菌感染性疾病，這類感染主要發(fā)生在醫(yī)院內(nèi)。近年來，多項(xiàng)流行病學(xué)研究顯示，IFI在免疫力低下的患者發(fā)病率逐漸升高，而且因IFI多合并細(xì)菌感染，其臨床癥狀易被基礎(chǔ)疾病所掩蓋，不能及時(shí)診斷和獲得抗真菌治療，其病死率居高不下，嚴(yán)重危及人類，尤其是免疫力低下患者的健康和生命，被稱為“臨終感染”[1]。治療IFI的關(guān)鍵在于早期診斷，早期適時(shí)使用抗真菌藥物。由于IFI早期癥狀和體征常缺乏特異性，故診斷存在一定困難，其主要原因一是缺乏具有代表性的臨床表現(xiàn)，二是缺少靈敏度和特異度都高的檢測手段。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)診斷方法，耗時(shí)長，敏感性差；組織病理診斷，作為一個(gè)侵入性操作，可行性差；影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性；因此，對于院內(nèi)侵襲性真菌感染的診斷，尋求和探索一種快速、高敏感度和高特異度的方法，已經(jīng)是該領(lǐng)域需要迫切解決的問題[2-3]。各項(xiàng)研究顯示，真菌細(xì)胞壁中含有大量 (1，3)-β-D葡聚糖成分，人體血液或深部組織中的吞噬細(xì)胞可以吞噬、消化真菌，使真菌細(xì)胞壁的 (1，3)-β-D葡聚糖釋放出來，血液和體液中既可以檢測到 (1，3)-β-D葡聚糖含量[4]。本研究收集高危院內(nèi)IFI感染患者的血漿，進(jìn)行 (1，3)-β-D葡聚糖含量的檢測，并與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法比較，分析兩種方法的診斷效能，探討G實(shí)驗(yàn)對院內(nèi)侵襲性真菌感染的診斷價(jià)值。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例的選擇

選擇寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院住院患者中高危院內(nèi)IFI患者132例 (住院時(shí)間2016.1～2017.4)。診斷入選標(biāo)準(zhǔn)：首先根據(jù)我國衛(wèi)生部頒發(fā)的《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]確定為院內(nèi)感染，參照歐洲癌癥研究和治療組織/深部真菌感染協(xié)作組和美國國立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組 (EORTC/MSG)共識組制定的IFI診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，分為四個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)：確診，臨床診斷，擬診和排除。

1.2 G實(shí)驗(yàn)

采用MB-80微生物快速檢測動(dòng)態(tài)系統(tǒng)及試劑檢 (北京金山川科技發(fā)展公司生產(chǎn))檢測入選病例血漿中 (1，3)-β-D葡聚糖含量。操作過程中注意避免各種污染及可能存在的熱原質(zhì)對標(biāo)本的影響。

1.3 真菌培養(yǎng)

根據(jù)標(biāo)本種類的不同接種在不同培養(yǎng)基上，25℃、37℃培養(yǎng)，每24 h觀察1次結(jié)果，根據(jù)菌落生長的形態(tài)，生長特點(diǎn)及色素進(jìn)行初級鑒別，如果生長為酵母菌的，進(jìn)一步將酵母菌接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上進(jìn)行分離鑒定，不能顯色的酵母類及非酵母類真菌根據(jù)其鏡下菌絲、孢子特征或進(jìn)一步小培養(yǎng)的生長特點(diǎn)進(jìn)行鑒定，仍不能確定的采用全自動(dòng)微生物分析儀 (VITEK 2 COMPACT)進(jìn)行鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，評價(jià)和比較真菌培養(yǎng)和G實(shí)驗(yàn)的診斷價(jià)值并進(jìn)行ROC曲線分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況

132例高危院內(nèi)IFI感染的患者中，共有43例診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染，其中確診9例，臨床診斷21例，擬診13例，排除89例；男性76例，女性58例，男性與女性性別比為1.31∶1；年齡最小的為11歲，最大的為90歲，平均年齡56.43±13.56歲。

2.2 檢測結(jié)果

真菌培養(yǎng)檢測結(jié)果 43例診斷為院內(nèi)IFI的患者 (包括確診、臨床診斷和擬診)，真菌培養(yǎng)陽性29例，標(biāo)本來自于血液，痰液，支氣管、肺泡灌洗液，尿液、腹水、鼻竇抽取液、腸道黏膜及深部組織；每例標(biāo)本均先行真菌直接涂片，后行真菌培養(yǎng)，3例深部組織同時(shí)行病理檢查；其中白念珠菌13例 (5例標(biāo)本來源為靜脈血，2例為痰液1例為尿液,1例為腹水，1例為腸道黏膜組織，1例為腎臟穿刺活檢組織)，占44.83%，熱帶念珠菌6例 (2例為血液，1例為痰液，1例為支氣管肺泡灌洗液，1例為尿液，1例為腹水)，占20.69%，光滑念珠菌3例 (1例為血液，1例為痰液，1例為尿液)，占10.34%，季也蒙念珠菌1例 (標(biāo)本為腹水)，占3.45%，曲霉5例 (2例為痰液，1例為支氣管、肺泡灌洗液，1例來自鼻竇抽取液，1例為支氣管鏡穿刺組織)，占17.24%，混合感染1例 (標(biāo)本為痰液)，占3.45%，3例深部組織病理檢查，有2例亦在組織病理切片中找到了真菌的菌絲和孢子。見表1。

G實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 43例診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染的43例患者血漿 (1-3)-β-D葡聚糖水平為20.34～819.84 pg/mL，平均132.34 pg/mL。本研究采用 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL為陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

真菌培養(yǎng)聯(lián)合G實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 真菌培養(yǎng)和G實(shí)驗(yàn)檢測兩項(xiàng)檢查中任一項(xiàng)檢測陽性或者兩項(xiàng)同時(shí)為陽性者即判斷為陽性。見表1。

表1 真菌培養(yǎng)、G實(shí)驗(yàn)及真菌培養(yǎng)聯(lián)合G實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

2.3 指標(biāo)分析

真菌培養(yǎng)、G實(shí)驗(yàn)及真菌培養(yǎng)聯(lián)合G實(shí)驗(yàn)檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值及Youden指數(shù)，見表2。

真菌培養(yǎng)、G實(shí)驗(yàn)及聯(lián)合檢測的ROC曲線分析，見表3、圖1。

3 討 論

近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，各種有創(chuàng)性檢查和治療手段在臨床上的廣泛開展，以及器官移植、導(dǎo)管技術(shù)、抗腫瘤藥物、糖皮質(zhì)激素及廣譜抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，以及人口老齡化等因素多種因素的作用下，使免疫受損人群不斷增加，侵襲真菌感染持續(xù)上升。這種感染主要發(fā)生在院內(nèi)，其死亡率也在不斷增加。美國的一項(xiàng)研究顯示，2000年院內(nèi)侵襲性真菌感染患者的死亡率較1979年增長了207%[7]。院內(nèi)侵襲性真菌感染的致病菌主要包括念珠菌，曲霉菌，隱球菌等，其中白念珠菌是主要致病菌[8]。此次調(diào)查顯示白念珠菌13例，占44.83%，排在其后的是熱帶念珠菌6例，占20.69%，曲霉5例，占17.24%，白念珠菌仍是我院主要致病菌。有研究表明，降低院內(nèi)侵襲性真菌感染相關(guān)死亡率的關(guān)鍵在于的早期診斷和早期應(yīng)用抗真菌藥物；以外，早期診斷和早期應(yīng)用抗真菌藥物還可以減少患者的住院費(fèi)用[9]。

表2 真菌培養(yǎng)、G實(shí)驗(yàn)及真菌培養(yǎng)聯(lián)合G實(shí)驗(yàn)檢測的敏感度、特異度、陽性、陰性預(yù)測值及Youden指數(shù)

Tab.2 Sensitivity, specificity and PPV,NPV,Youden of fungal culture,G test and combined detection for the diagnosis of IFI

檢測方法敏感度特異度陽性預(yù)測值陰性預(yù)測值Youden指數(shù)真菌培養(yǎng)0.670.960.720.800.63G實(shí)驗(yàn)0.700.880.730.860.58聯(lián)合檢測0.840.920.780.920.76

表3 真菌培養(yǎng)、G實(shí)驗(yàn)及聯(lián)合檢測的ROC曲線分析

圖1 真菌培養(yǎng)、G實(shí)驗(yàn)及聯(lián)合檢測的ROC曲線

Fig.1 ROC curves of fungal culture,G test and combined detection

目前臨床上對于真菌病原學(xué)檢查，真菌的鏡檢和培養(yǎng)仍然是一種常規(guī)的檢查方法，此次調(diào)查顯示真菌培養(yǎng)的敏感度為67%，特異度為96%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別是0.72和0.80，陽性率低，敏感性差，耗時(shí)長是該傳統(tǒng)方法的不足之處。盡管近幾年來傳統(tǒng)檢測手段較前有所改進(jìn)，特別是在念珠菌血癥的診斷上可以應(yīng)用全自動(dòng)血培養(yǎng)和檢測系統(tǒng)，使得血液中的念珠菌更高效的被檢測到。但各項(xiàng)研究表明，其敏感性仍較低，念珠菌血癥的檢出的陽性率只有50%左右[10]。隨著院內(nèi)侵襲性真菌感染菌種的變遷，曲霉菌感染所占比例逐漸增多，而曲霉在空氣中存在很多孢子和菌絲，真菌培養(yǎng)即使發(fā)現(xiàn)曲霉，也很難鑒別是致病菌還是污染菌，導(dǎo)致診斷困難。

近幾年，侵襲性真菌感染的血清學(xué)檢測方面取得了較大的進(jìn)展。真菌細(xì)胞壁中含有大量 (1，3)-β-D葡聚糖成分，多項(xiàng)研究表明，真菌細(xì)胞壁50%以上都是 (1-3)-β-D葡聚糖，而在酵母樣真菌中，(1-3)-β-D葡聚糖含量可更高，與此相反的是其他微生物及人的細(xì)胞中不含該成份。人體血液或深部組織中的吞噬細(xì)胞可以吞噬、消化真菌，使真菌細(xì)胞壁的 (1，3)-β-D葡聚糖釋放出來，血液和體液中既可以檢測到 (1，3)-β-D葡聚糖含量，而淺表真菌感染 (如口咽部念珠菌病等)或真菌定植時(shí) (1-3)-β-D葡聚糖極少釋放入血液中，因此血漿 (1-3)-β-D葡聚糖檢測是篩選侵襲性真菌感染的有用方法，具有臨床意義。此次調(diào)查顯示G實(shí)驗(yàn)對于院內(nèi)侵襲性真菌感染的敏感度為70%，特異度為88%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別是0.73和0.86，G試驗(yàn)不僅可檢測念珠菌感染還可以檢測曲霉、鐮刀菌等多種真菌，由于G實(shí)驗(yàn)敏感性相對較高，耗時(shí)短，一般只需要2 h，而普通的真菌培養(yǎng)則至少需要5 d，而且G試驗(yàn)檢測的特異性和敏感性不受抗生素影響，近年來G實(shí)驗(yàn)被廣泛用于侵襲性真菌感染血清學(xué)檢測，為早期診斷提供依據(jù)。此次調(diào)查結(jié)果顯示，43例診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染的患者，有8例為念珠菌血癥，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有7例，陽性率87.5%；20例考慮為肺部侵襲性真菌感染的患者，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有13例，陽性率65.0%；7例考慮為泌尿系侵襲性真菌感染的患者，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有5例，陽性率71.4%；6例考慮為消化道侵襲性真菌感染的患者，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有4例，陽性率66.7%；2例鼻竇侵襲性真菌感染患者，其血漿 (1-3)-β-D葡聚糖>60 pg/mL的有1例，陽性率50.0%。此結(jié)果顯示，G實(shí)驗(yàn)對念珠菌血癥的陽性率較高，而對肺部侵襲性真菌感染 (多為曲霉)的陽性率相對較低；這是因?yàn)樗拗鞯拿庖吡筒≡w的多少對曲霉感染所致血漿 (1-3)-β-D葡聚糖的變化有很大的影響。當(dāng)宿主免疫力較強(qiáng)，病原體較少時(shí)，厚壁的纖維組織會包繞霉菌，葡聚糖就不能進(jìn)入血中。

此外，30例血漿 (1-3)-β-D葡聚糖陽性的院內(nèi)侵襲性真菌感染的患者中，有26例G實(shí)驗(yàn)的檢測都在2次以上；13例血漿 (1-3)-β-D葡聚糖陰性的院內(nèi)侵襲性真菌感染的患者，其G實(shí)驗(yàn)均只檢測了1次，均為入院早期進(jìn)行的檢測，后期并未復(fù)查。因次，對于臨床高度懷疑院內(nèi)侵襲性真菌感染的病例，一次G實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，臨床中必須建立連續(xù)檢測的概念，連續(xù)檢測不僅僅是避免假陽性、假陰性的發(fā)生，還可以掌握評價(jià)抗真菌治療的療效，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥，為判斷預(yù)后及是否需要調(diào)整方案提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。此次調(diào)查結(jié)果顯示43例診斷經(jīng)G實(shí)驗(yàn)診斷為院內(nèi)侵襲性真菌感染的患者中，有23.3% (7/30)經(jīng)過抗真菌治療后，血中 (1-3)-β-D葡聚糖水平先增高，后下降，最后降為正常水平，有44.3% (13/30)經(jīng)過抗真菌治療后，血漿 (1-3)-β-D葡聚糖水平直線下降，患者臨床感染癥狀亦得到有效控制，另有6.7% (2/30)經(jīng)過抗真菌治療后，血漿 (1-3)-β-D葡聚糖水平一直未明顯下降，臨床感染癥狀亦未得到有效控制。

但G實(shí)驗(yàn)也同樣存在不足之處：首先G試驗(yàn)的陽性結(jié)果只能代表存在侵襲性真菌感染，但是并不能夠確定其種類，而且由于β-葡聚糖普遍存在周圍環(huán)境中，G實(shí)驗(yàn)有假陽性結(jié)果，如應(yīng)用纖維素膜進(jìn)行透析、紗布以及其他醫(yī)療物品中含有葡聚糖、污染、敗血癥患者 (尤其是鏈球菌血癥)、某些抗腫瘤藥物 (香菇多糖、裂殖菌多糖)、某些靜脈制劑 (白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子)的使用、磺胺類藥物、個(gè)人飲食 (某些患者喜歡吃蘑菇類食物)等[11]，同時(shí)，G實(shí)驗(yàn)還存在一些假陰性因素，如G試驗(yàn)不能檢測隱球菌和接合菌，因?yàn)殡[球菌細(xì)胞壁為α-葡聚糖而非 (1-3)-β-D葡聚糖，故隱球菌感染的檢測結(jié)果為陰性，除此之外使用某些抗真菌藥物如卡泊芬凈，可非競爭性抑制 (1-3)-β-D葡聚糖的合成，標(biāo)本放置時(shí)間過長等都會導(dǎo)致G實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

本次研究還顯示，G實(shí)驗(yàn)和真菌培養(yǎng)聯(lián)合檢測的敏感度提高為84%，特異度提高為92%，陽性預(yù)測值0.78，陰性預(yù)測值0.92；Youden指數(shù)范圍為[-1,1]，數(shù)值越高，診斷價(jià)值越高，G實(shí)驗(yàn)Youden指數(shù)0.58，真菌培養(yǎng)Youden指數(shù)0.63，聯(lián)合檢測Youden指數(shù)提高到0.76，因此，聯(lián)合檢測的診斷價(jià)值要高于單獨(dú)真菌培養(yǎng)及G實(shí)驗(yàn)檢測的診斷價(jià)值。另一方面，將43例院內(nèi)侵襲性真菌感染患者的G實(shí)驗(yàn)結(jié)果、真菌培養(yǎng)結(jié)果及聯(lián)合檢測結(jié)果進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積分別為0.717,0.757及0.798，ROC曲線下面積越大，說明診斷意義越好。聯(lián)合檢測的診斷意義高于單獨(dú)真菌培養(yǎng)或G實(shí)驗(yàn)的診斷意義。因此，對于臨床懷疑侵襲性真菌感染的患者，建議真菌培養(yǎng)和G實(shí)驗(yàn)同時(shí)送檢，并加強(qiáng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測，發(fā)揮G實(shí)驗(yàn)和真菌培養(yǎng)各自的優(yōu)勢，為院內(nèi)侵襲性真菌感染的早診斷、早治療及療效判定提供快速和準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。