超聲聯(lián)合兩性霉素B納米粒對白念珠菌生物膜殺菌效果評價

楊敏 謝霜 董宇 杜永洪 李岱容

(1.重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學工程學重點實驗室，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥科，重慶 400016)

白念珠菌 (C.albicans)是人類最常見的條件致病菌。近年來，隨著抗生素和激素的廣泛使用及生物材料體內(nèi)植入應(yīng)用增多，白念珠菌的感染率和死亡率逐年提高，已成為臨床上不可忽視的真菌感染。其感染的特殊性和難治性在于白念珠菌易形成生物膜，生物膜使真菌耐藥性大大增加，感染經(jīng)久不愈[1-2]。兩性霉素B是目前臨床上廣泛使用一線抗真菌藥，研究表明其對于大多數(shù)浮游態(tài)真菌敏感性高，但在治療生物膜感染時也顯得力不從心，且毒副作用很大[3]。

納米粒子作為一種新型載體將藥物包載入內(nèi)，通過體外一定強度超聲波輻照破壞載藥粒子后，實現(xiàn)藥物的靶向釋放，具有提高藥物療效、減少藥物用量、降低毒副作用等優(yōu)點，表現(xiàn)出極有潛力的臨床應(yīng)用前景。納米粒破裂可增加超聲空化效應(yīng)和機械效應(yīng)，可使細胞質(zhì)膜通透性增加，提高藥物的滲透性[4-5]。PLGA是一種具有良好生物相容性的可降解材料，可作為藥物載體[6]。本實驗預(yù)將抗真菌藥物兩性霉素B包載入PLGA納米粒內(nèi)，聯(lián)合低頻超聲輻照，探究超聲聯(lián)合載藥納米粒對白念珠菌生物膜的協(xié)同抗菌作用，以期達到藥物增效和靶向釋放作用，為真菌生物膜感染治療提供一種新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌標準菌株ATCC90028由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科惠贈。

藥品與試劑 兩性霉素B (AmB)，甲基四氮鹽 (XTT)，甲萘醌，偶氮酪蛋白 (MSDS)，大豆卵磷脂，上述藥品均購置于美國Sigma公司，聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (PLGA聚合比50∶50，分子量21 000，深圳博立公司)，胎牛血清 (FBS)，RPMI 1640培養(yǎng)液購于美國Hycline公司，熒光染料SYTO9/PI購于美國Nvitrogen公司，三氯乙酸，氫氧化鈉購于上海阿拉丁公司。

儀器 低頻低強度超聲儀 (由重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院研制，固定頻率為42 Hz，輸出聲強為0.15～0.6 W/cm2，連續(xù)可調(diào))，馬爾文激光粒度儀 (Zeta SIZER 3000HS，美國)，TCS-SP2激光共聚焦顯微鏡 (Leica TCS SP5，德國)，紫外分光光度計 (Thermo Scientific NanoDrop 2000)，SpectraMax M2e多功能酶標儀 (美谷分子儀器有限公司)。

1.2 方法

白念珠菌生物膜制備 采用細胞培養(yǎng)板法建立體外生物膜模型[7]。從沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上挑取2～3個單菌落接種于100 mL滅菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，37℃、150 r/min培養(yǎng)18 h,離心收集菌體，RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度為3×106CFU/mL。取1 mL菌液接種于35 mm細胞培養(yǎng)板中，37℃恒溫箱中培養(yǎng)2 h后，棄去培養(yǎng)液，以PBS輕輕沖洗未黏附的懸浮菌，另加入1 mL RPMI 1640培養(yǎng)液 (含有10%FBS)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

AmB-NPs的制備及檢測 采用雙乳化法制備載AmB的PLGA納米粒[8]：稱取PLGA高分子材料，攪拌致完全溶于二氯甲烷中，取200 μL AmB (5 mg/mL)加入到PLGA溶液中，并置于旋渦震蕩儀振蕩10 s，調(diào)節(jié)超聲振蕩儀功率為100 W、冰浴的條件下乳化2 min形成初乳 (water-in-oil，W/O)，再加入配置好的1%PVA溶液2.5 mL，使用高速分散均質(zhì)機均質(zhì)3 min制成復(fù)乳 (water-in-oil-in-water，W/O/W)，將復(fù)乳放在恒溫磁力攪拌器上持續(xù)攪拌3 h使二氯甲烷充分揮發(fā)，離心、洗滌收集納米粒。然后將納米粒放入低溫真空干燥機中干燥24 h后，稱量納米?？傎|(zhì)量。取少量納米粒加蒸餾水稀釋，光鏡下觀察納米粒形態(tài)，馬爾文激光粒度儀檢測納米粒的粒徑及電位，并利用以下公式分別計算納米粒載藥率 (DL)和包封率 (EE)。DL (%)=(AmB在納米粒中的量/載藥納米?？偭?×100%,EE (%)=(AmB在納米粒中的量/AmB總投入量)×100%。

AmB及AmB-NPs對固著性白念珠菌生物膜最小抑菌濃度 (SMIC)測定[9]取100 μL配制好的菌液 (3×106CFU/mL)加入96孔板中，48 h生物膜形成后，PBS輕輕沖洗三遍，將AmB及AmB-NPs以RPMI 1640為溶劑二倍稀釋法配制0.5～32 μg/mL的藥物濃度，以不加藥物的RPMI 1640培養(yǎng)液為陽性對照組，每個濃度重復(fù)5孔，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。用XTT減低法測量AmB和AmB-NPs抑制50% (SMIC50)及80% (SMIC80)生物膜活性的最低藥濃度 (即吸光值相對于陽性對照組下降50%、80%以上的最低濃度)。

實驗分組及超聲輻照方式 在培養(yǎng)48 h獲得成熟生物膜后，以PBS輕輕沖洗未黏附的浮游菌，隨機將生物膜分為對照組 (Control)、超聲組 (US)、空納米粒組 (NPs)、超聲聯(lián)合空納米粒組 (US+NPs)、AmB組 (AmB)、超聲聯(lián)合AmB組 (US+AmB)、AmB納米粒組 (AmB-NPs)、超聲聯(lián)合AmB納米粒組 (US+AmB-NPs),共8個組，每組重復(fù)3個標本。實驗組分別加入1 mL NPs、AmB和AmB-NPs溶液，AmB藥物濃度均為4 μg/mL，對照組加入1 mL PBS溶液。將低頻超聲探頭末端均勻涂抹偶合劑，緊貼于細胞培養(yǎng)板下端輻照，避免氣體干擾。超聲輻照頻率為42 kHz,強度為0.15 W/cm2,輻照時間為5 min，其中Control組、NPs組、AmB組、AmB-NPs組進行超聲假照 (換能器關(guān)閉狀態(tài))，輻照完成后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

生物膜活性檢測 采用XTT減低法分析各組生物膜活性改變[10]，將超聲處理后的生物膜用移液槍反復(fù)沖洗、吹打并轉(zhuǎn)入96孔板中，分別加入100 μL配置好的無菌XTT-甲萘醌溶液，37℃避光孵育2 h后，酶標儀測量各孔在490 nm吸光值，直接反應(yīng)生物膜內(nèi)細胞的活性。

激光共聚焦觀察生物膜形態(tài)學變化 將超聲處理后的生物膜用PBS輕輕沖洗兩次，加入50 μL熒光染料SYTO9/PI，37℃避光孵育20 min，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，從生物膜底層至頂層以層間距0.5 μm逐層掃描，并重建生物膜三維熒光結(jié)構(gòu)圖。

生物膜蛋白酶和磷脂酶活性分析 采用酶底復(fù)合物法[11-12]分析生物膜酶活 性變化。超聲聯(lián)合微球作用生物膜24 h后，用移液槍反復(fù)沖洗、吹打、粉碎生物膜，離心重懸于PBS中，取上清液500 μL與1%偶氮酪蛋白 (體積比1∶9)混合，37℃反應(yīng)1 h后，加入500 μL 10%三氯乙酸停止反應(yīng)，離心取上清液500 μL與0.5 mol/L氫氧化鈉混合，37℃反應(yīng)15 min后，采用紫外分光測量在440 nm吸光值。將同等量的生物膜上清液與卵磷脂混合，37℃反應(yīng)1 h后，采用紫外分光測量在630 nm吸光值。在給定條件下，每分鐘使吸光值增加0.001的酶量為一個酶活單位 (U),每g生物膜干重所含酶活單位為酶特異性活力 (U/g dry wight)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié) 果

2.1 PLGA載藥微球特性

光鏡下見兩性霉素B納米粒呈球形，形態(tài)規(guī)則，大小較為均勻 (見圖1)。馬爾文激光粒度儀檢測出AmB-NPs平均粒徑為343.17±24.74 nm，Zeta電位為-10.9±1.9 mV。并計算出兩性霉素納米粒的載藥率為5.7%，包封率為85%。

2.2 AmB及AmB-NPs對白念珠菌生物膜SMIC

AmB-NPs對白念珠菌生物膜SMIC50的濃度為8 μg/mL，SMIC80的濃度大于32 μg/mL，AmB對生物膜的SMIC50和SMIC80分別為4 μg/mL、32 μg/mL。結(jié)果表明白念珠菌生物膜對AmB及AmB-NPs敏感性相比于浮游菌均明顯降低 (MIC=0.5 μg/mL)[9]。

2.3 超聲聯(lián)合載藥微球?qū)ι锬せ钚杂绊?/h3>

XTT減低法定量檢測各組實驗處理后白念珠菌生物膜活性變化，結(jié)果顯示 (見圖2)，與Control組相比，AmB組、US+AmB組、AmB-NPs組、US+AmB-NPs組抑菌率分別為46.65%、56.75%、41.98%、74.64% (P<0.01)。顯然，經(jīng)超聲聯(lián)合AmB-NPs作用后，對生物膜活性抑菌效果更明顯。同時，US組與NPs組生物膜活性也呈降低趨勢，說明低頻超聲和納米粒也能一定程度上殺菌，但與對照組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。

2.4 超聲聯(lián)合載藥微球?qū)ι锬ば螒B(tài)結(jié)構(gòu)觀察

激光共聚焦重建不同處理組生物膜三維結(jié)構(gòu)圖，綠色代表活菌，紅色代表死菌。結(jié)果顯示 (見圖3)對照組以綠色熒光為主，活菌生長致密，形成具有一定厚度的緊密三維立體結(jié)構(gòu) (厚度約為30.5 μm)。US組與NPs組熒光強度及結(jié)構(gòu)致密性與對照組無明顯變化，但US+NPs組紅色熒光開始增強，結(jié)構(gòu)也較對照組稀疏，說明超聲聯(lián)合空納米粒也具有一定殺菌作用。經(jīng)藥物及藥物聯(lián)合超聲作用后，生物膜結(jié)構(gòu)稀疏，厚度變薄，死菌增多，當超聲聯(lián)合AmB-NPs作用后，生物膜基本以紅色熒光 (死菌)為主，僅基本無活性生物膜殘留 (厚度約19.0 μm)。

2.5 生物膜蛋白酶磷脂酶活性分析

蛋白酶和磷脂酶是白念珠菌生物膜兩種重要的毒力因子，利用酶底復(fù)合物法檢測各組酶活性，結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，超聲聯(lián)合AmB-NPs組蛋白酶和磷脂酶的活性分別降低了68.41%、68.57%，差異具有明顯統(tǒng)計學意義 (P<0.01)，且酶活性均低于AmB組 (P<0.05)，表明超聲聯(lián)合AmB-NPs作用可以提高抑制蛋白酶磷脂酶活性的能力，削弱毒力因子的表達，從而降低生物膜的致病性。

圖1 光鏡下AmB-NPs形態(tài)及分布 (×400) 圖2 XTT減低法定量檢測各實驗處理后白念珠菌生物膜吸光值，反應(yīng)生物膜活性改變。AmB藥物終濃度為4 μg/mL，超聲輻照參數(shù) (42 kHz,0.15 W/cm2,5 min)。與對照組及藥物組比較，**P<0.01 圖3 激光共聚焦重建不同處理組白念珠菌生物膜三維結(jié)構(gòu)圖 (×200) 圖4 白念珠菌生物膜不同處理組的蛋白酶 (A)磷脂酶 (B)活性測定，與對照組比較，**P<0.01，與AmB組比較，P<0.05

Fig.1 Morphology and distribution of AmB-NPs under light microscope (×400) Fig.2 TheC.albicansbiofilms of different samples was evaluated by XTT reduction assay. The final concentration of AmB in group AmB and AmB-NPs was 4 μg/mL. Ultrasonic irradiation parameters (42 kHz,0.30 W/cm2, 5 min). The double asterisk (**) denotes a statistically significant difference compared to the control group and drug group (P<0.01) Fig.3 Confocal laser scanning microscopy reconstructed the different groups ofC.albicansbiofilm three-dimensional structure (×200) Fig.4 The specific activities of proteinase (A) phospholipase (B) of different treatment groups ofC.albicansbiofilm. Compared with control group,**P<0.01, compared with AmB group,P<0.05

3 討 論

白念珠菌生物膜是一種附著于組織或生物材料表面的微菌落，并被自身分泌的細胞外基質(zhì) (EMC,主要糖類和蛋白質(zhì))包裹，生物膜結(jié)構(gòu)致密形成一層天然屏障，導(dǎo)致抗菌藥物難以穿透EMC進而消滅生物膜內(nèi)菌體，藥物的低滲透率是產(chǎn)生耐藥的重要原因[13-14]。而超聲作為一種無創(chuàng)技術(shù)已在醫(yī)學上得到了廣泛運用，低頻超聲 (頻率為20 kHz～1 MHz)能夠提高細胞膜通透性，增加藥物滲透從而達到協(xié)同抗菌作用已取得了眾多研究者的共識[15-16]?；诖?，本實驗著重研究了抗菌藥物聯(lián)合超聲輻照對白念珠菌生物膜的抑制作用，并將藥物用PLGA包載形成載藥納米粒，以期降低兩性霉素B的毒性。

本實驗采用直徑為35 mm的聚乙烯培養(yǎng)板成功建立了體外白念珠菌生物膜模型，采用低頻超聲聯(lián)合載藥納米粒作用于成熟生物膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅以AmB SMIC50濃度聯(lián)合超聲作用時，生物膜活性降低可達85%以上，抗菌效果明顯優(yōu)于游離AmB藥物或超聲聯(lián)合AmB，同時共聚焦也顯示超聲聯(lián)合載藥納米粒作用后生物膜厚度變薄，結(jié)構(gòu)疏松，僅部分無活性的死菌殘留。表明超聲聯(lián)合載藥納米粒對生物膜產(chǎn)生高效協(xié)同抗菌作用，推測這可能超聲空化效應(yīng)有關(guān)。首先是空化效應(yīng)及伴隨的高壓、高剪切力等極端物理現(xiàn)象可一定程度疏松生物膜致密EMC結(jié)構(gòu)，增強生物膜的藥物滲透性。進一步超聲空化效應(yīng)產(chǎn)生的沖擊波、微射流對細菌細胞膜產(chǎn)生“聲孔效應(yīng)”，這種“臨時通道”促進抗菌藥物進入菌體內(nèi)部的量增多。而載藥納米粒的加入大大增加了空化核的數(shù)量, 降低了局部空化閾值,增強空化效應(yīng)，超聲輻照納米粒破裂釋放藥物發(fā)揮高效抗菌作用[17-18]。

白念珠菌能產(chǎn)生多種毒力因子,其中分泌型酸性蛋白酶和細胞外磷脂酶是兩種重要的毒力因子,目前認為,白念珠菌的侵襲性與這兩種酶活力密切相關(guān)[19]。文獻報道這兩種酶在白念珠菌芽體及菌絲中存在，并將水解聚合物作為白念珠菌的營養(yǎng)源[20]。本實驗以偶氮酪蛋白和卵磷脂為底物，測量了超聲聯(lián)合載藥微球干預(yù)后蛋白酶和磷脂酶活力的變化，結(jié)果顯示超聲聯(lián)合AmB-NPs可以明顯降低蛋白酶磷脂酶的活性，這可能與生物膜結(jié)構(gòu)破壞，細胞外基質(zhì)清除有關(guān)。

綜上，本實驗證實了低頻超聲聯(lián)合PLGA載兩性霉素B納米粒能夠顯著提高對白念珠菌生物膜的抗菌效果。適合的超聲設(shè)備有望為臨床上淺表部位的真菌感染包括霉菌性陰道炎、外科手術(shù)的真菌感染如關(guān)節(jié)置換和生物導(dǎo)管植入后引起的白念珠菌感染等，提供一種新的無創(chuàng)治療思路。例如利用超聲婦科治療儀聯(lián)合藥物治療陰道炎，將有望提高治療效果，縮短治療療程。超聲作為一種無創(chuàng)或微創(chuàng)手段協(xié)同藥物治療在臨床上有著巨大的應(yīng)用潛力。