人循環(huán)T細(xì)胞免疫指數(shù)模型評估結(jié)直腸癌患者手術(shù)預(yù)后的價(jià)值

秦靚 傅超 俞艷艷 丁菁 武文靜 姚江穎 何俊 張建鋒 張亮亮

結(jié)直腸癌是消化道常見的高度惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[1]。盡管惡性腫瘤手術(shù)、放化療等治療取得了較大進(jìn)展，但針對結(jié)直腸癌手術(shù)預(yù)后（生存及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）的結(jié)果欠佳[1]。因此，尋找適宜的結(jié)直腸癌患者手術(shù)預(yù)后指標(biāo)或標(biāo)志物，以盡早發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良的高危患者是目前研究熱點(diǎn)及難點(diǎn)[2]。研究表明，浸潤性細(xì)胞免疫反應(yīng)的改變與機(jī)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系密切[3]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道許多外周循環(huán)血細(xì)胞指標(biāo)（如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等）可預(yù)測惡性腫瘤患者的預(yù)后，但對結(jié)直腸癌的預(yù)測報(bào)道很少[4]。本研究以CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞為研究基礎(chǔ)，建立循環(huán)淋巴細(xì)胞免疫指數(shù)（circulating T-cell immune index，CTII）模型，探討其與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系以及評估手術(shù)預(yù)后的價(jià)值。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2010年1月至2013年1月行手術(shù)切除且經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌的138例患者（杭州市第三人民醫(yī)院124例，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院14例）為研究對象，其中男 83例，女 55例；年齡 30～72（44.37±12.7）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者接受相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)直腸癌治療策略；（2）采集血標(biāo)本前均未接受過其他任何抗腫瘤、輸血、放化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并感染性疾病導(dǎo)致淋巴細(xì)胞異常者；（2）患有血液系統(tǒng)、骨髓系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)的疾?。唬?）合并其他腫瘤患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CTII模型的建立 收集所有患者術(shù)前的循環(huán)CD4+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞、CD8+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞、CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的檢查資料，并計(jì)算CTII，CTII=CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞/（CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞×CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）。患者的年齡、性別、腫瘤TNM分期、腫瘤直徑、腫瘤位置、分化程度、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)等資料均依據(jù)病程記錄和檢查報(bào)告進(jìn)行歸納。

1.2.2 隨訪計(jì)劃的制定 通過患者復(fù)診、電話、信件等方式進(jìn)行隨訪，術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月隨訪1次，2年后每6個(gè)月隨訪1次。術(shù)后隨訪5年，截止至2018年1月，失訪10例（包括非腫瘤相關(guān)死亡患者）。研究的主要終點(diǎn)事件為無病生存期（RFS）和總生存期（OS）。RFS：手術(shù)之日至第1次出現(xiàn)局部或區(qū)域復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、隨訪終止或死亡的時(shí)間。OS：手術(shù)之日至出現(xiàn)任何原因引起的死亡或隨訪終止的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。根據(jù)ROC曲線計(jì)算CTII預(yù)測結(jié)直腸癌患者5年生存期的最佳截點(diǎn)值；采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析CTII與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系。采用Kaplan-Meier曲線、log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，并運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響結(jié)直腸癌患者RFS和OS的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTII臨界值的確定及分組 CTII模型預(yù)測本研究結(jié)直腸癌患者5年RFS和OS的AUC分別為0.702和0.679，見圖1。根據(jù)AUC面積的比較以及相應(yīng)約登指數(shù)的計(jì)算，確定以RFS為研究基礎(chǔ)，獲得CTII最佳截點(diǎn)值為0.08。根據(jù)最佳截點(diǎn)值將結(jié)直腸癌患者分為高CTII組（≥0.08）76例和低CTII組（＜0.08）62例。

圖1 CTII模型預(yù)測結(jié)直腸癌患者5年RFS和OS的ROC曲線（a：RFS分析；b：OS分析）

2.2 CTII與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系 不同CTII組患者的TNM分期、分化程度以及循環(huán)CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 CTII與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系

2.3 CTII與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后生存分析 高CTII組患者RFS、OS均明顯低于低CTII組（均P＜0.01），見圖2。

2.4 影響結(jié)直腸癌患者RFS和OS的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析 單因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、分化程度、CTII指數(shù)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后RFS和OS密切相關(guān)（均P＜0.05）；而腫瘤直徑、循環(huán)CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞僅與RFS有關(guān)（均P＜0.05），CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞僅與OS有關(guān)（P＜0.05）。將上述P＜0.05的因素納入多因素分析，結(jié)果顯示TNM分期、分化程度、CTII是影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后RFS和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見表2。

圖2 CTII與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生存曲線（a：RFS分析；b：OS分析）

3 討論

近年來研究證實(shí)，炎癥免疫細(xì)胞浸潤會(huì)改變腫瘤微環(huán)境，參與或抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[5]。相關(guān)研究表明，免疫細(xì)胞指數(shù)模型可作用于腫瘤免疫機(jī)制，從而發(fā)揮作用[6]。因此，免疫細(xì)胞指數(shù)模型可能成為惡性腫瘤的新生物標(biāo)志以及判斷預(yù)后的細(xì)胞靶點(diǎn)。CTII模型是以CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞為研究基礎(chǔ)，通過拮抗-促進(jìn)的相互作用來調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的免疫防御功能，在臨床上具有準(zhǔn)確的預(yù)測價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其致死率較高[1]。因此，亟需尋找一種新的腫瘤標(biāo)志物來判斷預(yù)后，以提高結(jié)直腸癌的個(gè)體化治療效果。Hagland等[7]報(bào)道在循環(huán)淋巴細(xì)胞于Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者分布中，CD4+及CD8+T細(xì)胞參與惡性腫瘤侵襲，進(jìn)而影響預(yù)后。進(jìn)一步研究表明，CTII與多種惡性腫瘤遠(yuǎn)期預(yù)后密切相關(guān)，如肺癌、肝癌、胰腺癌[8-10]。目前關(guān)于CTII對結(jié)直腸癌的預(yù)測價(jià)值尚不清楚。因此，本研究從結(jié)直腸癌患者外周血細(xì)胞入手，利用ROC曲線評價(jià)結(jié)直腸癌患者預(yù)后，發(fā)現(xiàn)CTII模型在RFS所對應(yīng)的AUC大于OS所對應(yīng)的AUC，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在一定程度上提示RFS的最佳截點(diǎn)在評價(jià)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的準(zhǔn)確性方面具有優(yōu)勢。進(jìn)一步分析CTII與臨床特征及預(yù)后生存的關(guān)系，結(jié)果表明CTII與TNM分期、分化程度有關(guān)，推測CTII變化可能打破腫瘤微環(huán)境免疫平衡，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。亦有研究表明TNM分期、分化程度是影響結(jié)直腸癌治療及預(yù)后的指標(biāo)[11]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)CTII與結(jié)直腸癌患者術(shù)后的RFS和OS密切相關(guān)，高CTII提示預(yù)后較差。同時(shí)進(jìn)一步作Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，證實(shí)TNM分期、分化程度、CTII是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。可見，CTII可作為評價(jià)結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和OS的預(yù)測指標(biāo)。

表2 影響結(jié)直腸癌患者RFS和OS的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

目前關(guān)于上述規(guī)律的發(fā)生機(jī)制尚未證實(shí)，主要認(rèn)為惡性腫瘤的發(fā)生起點(diǎn)在于感染或炎癥反應(yīng)，此類感染或炎癥可引起CTII升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞增多，或CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少。CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要炎性細(xì)胞，與腫瘤-免疫平衡的發(fā)生、發(fā)展存在相互效應(yīng)。一方面，腫瘤細(xì)胞可釋放粒細(xì)胞集落刺激因子、IL-2、TNF等細(xì)胞因子，從而促進(jìn)CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞大量增殖[12]；另一方面，CD28+細(xì)胞毒性 T細(xì)胞通過 PD-1、GSK-3等途徑與腫瘤細(xì)胞對抗[13]。這意味著CD28+細(xì)胞毒性T細(xì)胞可間接反映腫瘤惡性程度。此外，有研究表明，CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)以及釋放的細(xì)胞因子，均能抑制腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移行為[14]。隨著腫瘤的生長，機(jī)體炎癥與抗腫瘤之間失去平衡，體內(nèi)循環(huán)淋巴細(xì)胞比例發(fā)生變化。因此，外周血CTII高則反映患者全身炎性反應(yīng)較嚴(yán)重，抗腫瘤免疫功能較差，提示預(yù)后不良。

綜上所述，CTII模型對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的評估具有指導(dǎo)價(jià)值，是一項(xiàng)易檢測、重復(fù)性好、價(jià)格低廉的腫瘤相關(guān)性炎癥指標(biāo)；其中高CTII提示預(yù)后不良。聯(lián)合中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、血小板/淋巴細(xì)胞等因素建立模型，對結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的診斷具有參考價(jià)值[15-16]；建議進(jìn)一步聯(lián)合多指標(biāo)進(jìn)行研究，以提高預(yù)測的準(zhǔn)確性。